المناعية الأقسام مملوءة Biocytin والمجهزة لالكيميائية العصبية علامات

الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم طريقة فعالة لتحديد الخلايا العصبية المصححة أثناء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام البيويسيتين والتلوين المناعي لاستعادة التشكل قبل إعادة تلطيخه بأجسام مضادة محددة لتحديد الهوية الكيميائية العصبية. لذلك تصف هذه الطريقة خطوة مهمة مطلوبة لدراسة التنوع في بنية الخلايا العصبية ووظيفتها. هذا ضروري لفهم دورهم في شبكات الدماغ.

الميزة الرئيسية لاستخدام تقنيات المعالجة المتسلسلة ، هي أنها تقضي على فقدان البيانات بسبب عدم القدرة على استعادة التشكل. لذلك يساعد هذا أيضا في توجيه العلامات الكيميائية العصبية التي سيتم اختبارها في هذه الخلايا. على الرغم من أن هذه الطريقة موصوفة للتعافي المورفولوجي للخلايا في أقسام سميكة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأقسام الرقيقة وعلى العينات الملطخة والمثبتة مسبقا.

بشكل عام ، قد يواجه المحايدون الجدد في هذه الطريقة صعوبة في إعادة إغلاق سوما أثناء الانفصال عن الخلية ، وقد يفشلون في إتاحة الوقت الكافي لملء النجاح. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث أن هناك حاجة إلى تقنيات محددة لملء الخلايا الحيوية بشكل فعال من أجل استعادة التشكل الكامل. لبدء هذا الإجراء ، في تكوين مشبك الجهد ، قم بتطبيق خطوات جهد صغيرة موجزة باستخدام وظيفة اختبار الغشاء في وضع الحمام أثناء الاقتراب من الخلية.

رقعة على الخلية عن طريق تطبيق الشفط. بعد ذلك ، أمسك الخلية عند سالب 70 مللي فولت. لاحظ تطور ختم جيجاأوم.

عوض العابرين بالسعة ثم قم بتطبيق الشفط المتحكم فيه باستخدام حقنة أو عن طريق الفم لتحقيق تكوين الخلية بالكامل. تقدير سعة الخلية بأكملها ومقاومة السلسلة ، وإيقاف نبضات اختبار الغشاء. مقاومة السلسلة التي تقل عن 10 ميغا أوم هي الأمثل.

سيضمن ذلك إنشاء ظروف تسجيل الخلية بأكملها للسماح بملء البيوسيتين. عند الانتهاء من التسجيلات الفسيولوجية، أعد إنشاء تكوين مشبك التصحيح عن طريق تحريك ماصة التسجيل ببطء في خطوات صغيرة، بالتناوب لأعلى وللخارج في وضع مشبك الجهد. تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في تحقيق التعافي المورفولوجي للخلايا في ضمان إعادة إغلاق سوما العصبية أثناء فصل ماصة التسجيل عن الخلية.

باستخدام وظيفة اختبار الغشاء، تصور فقدان العابرين بالسعة وانهيار الاستجابات الحالية لخط مستقيم، مما يشير إلى إعادة إغلاق الخلية وإنشاء رقعة خارجية للخارج عند طرف الماصة. في غضون ذلك ، فإن الاحتفاظ بالخلية في إمكانات إزالة الاستقطاب سيسهل عملية إعادة الختم. بعد فصل الماصة عن الخلية ، احتفظ بالشريحة في غرفة التسجيل لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لضمان انتقال الصبغة إلى العمليات التغصنية والمحورية البعيدة.

بعد ذلك ، انقل الشريحة إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 4٪ PFA للتثبيت. بعد 24 إلى 48 ساعة من تثبيت PFA ، انقل جميع الشرائح الثابتة إلى نقطة صفر واحدة مولار PBS للتخزين قبل التلوين المناعي. في هذا الإجراء ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها نقطة صفر مولار واحدة PBS.

بعد ذلك ، قم بحظر الأنسجة بنسبة 10 في المائة من مصل الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضان الأقسام في الأجسام المضادة الأولية CB1R في درجة حرارة الغرفة طوال الليل لتحديد تعبير مستقبلات القنب من النوع 1. ثم اغسل أقسام الدماغ ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها 0.1 مولار PBS.

يضاف كل من الستربتافيدين والجسم المضاد الثانوي للجسم المضاد الأولي الأول إلى لوحة البئر ويحفظ طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم باحتضان الأقسام في الصبغة الحمراء الستربتافيدين عند أربع درجات مئوية طوال الليل في الظلام للكشف عن البيوسيتين. بعد ذلك ، اغسل أقسام الدماغ ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها 0.1 مولار PBS.

لحماية الإزهار وتسهيل إعادة الطلاء في المستقبل ، قم بتركيب الأقسام في وسط تثبيت متباعدة بشكل متساو. قم بإغلاق حواف زلات الغطاء بطلاء أظافر شفاف. في هذه الخطوة ، قم بإزالة طلاء الأظافر من الشريحة الزجاجية بقطعة قطن من الأسيتون.

قم بإزالة زلة الغطاء بعناية باستخدام ملقط طرف رفيع وضع بضع قطرات من 0.1 مولار PBS على الأقسام. من الأهمية بمكان عدم إتلاف أنسجة العملية أثناء فك الأنسجة من وسط التركيب المائي. قم بإزالة الأقسام بعناية من الشريحة باستخدام فرشاة رسم دقيقة واغسلها في 0.1 مولار PBS لمدة 24 إلى 48 ساعة على شاكر ، وابتعد عن الضوء في أربع درجات مئوية.

لضمان الإزالة الكاملة لوسط التثبيت ، اغسل الأقسام مرة إلى مرتين في اليوم التالي في 0.1 مولار PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. ثم احتضان الأقسام بجسم مضاد أولي ثان كوليسيستوكينين ليوم واحد. اغسل أقسام الدماغ ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها 0.1 مولار PBS.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بجسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروفور مضاد للفأر. التأكد من أن أطياف انبعاث الإثارة للجسم المضاد الثانوي لا تتداخل مع الستربتافيدين والبقع المناعية الفلورية السابقة. بعد ذلك ، قم بتركيب الأقسام في وسط تركيب مائي.

بإغلاق حواف زلة الغطاء بطلاء أظافر شفاف. بعد ملء البيويسيتين الناجح وعملية التلوين المناعي الأولى ، يمكن تصور البنية العصبية وتصويرها كما هو موضح في الصورة متحد البؤر التي تم الحصول عليها بتكبير 60x. تم تلطيخ القسم أيضا بالمناعة ل CB1R جنبا إلى جنب مع biocytin ، ويشار إلى التلوين المناعي CB1R في biocytin الذي يعبر عن سوما العصبية بواسطة رأس السهم.

تمت معالجة نفس القسم للتفاعل المناعي CCK بعد أسبوع واحد ، وتظهر الصورة التعافي الناجح لوضع العلامات المناعية ل CCK في العديد من الخلايا العصبية المشار إليها بعلامة النجمة. لاحظ أن الخلية المسماة ب biocytin المشار إليها بواسطة رأس السهم لم تعبر عن CCK. تظهر الصورة المدمجة للوحات A و B و C أن جميع الملصقات الثلاثة يتم تصورها بقوة ، وأن التراكب بين biocytin و CB1R واضح.

توضح الصورة أن عملية التلوين المناعي الثانية لا تضر بالإشارة من عملية التلوين السابقة. تم الحصول على مورفولوجيا الخلية المملوءة بالسيتين الحيوي من الصور متحدة البؤر قبل التلوين المناعي CCK. بشكل حاسم ، بالإضافة إلى سوما والتغصنات ، يمكن تصور المحاور ، ولوحظ وضع العلامات المشتركة على العمليات المحورية المسماة CB1R والبيويسيتين.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استهداف الخلايا السليمة الموجودة أسفل سطح الشريحة لتجنب الخلايا العصبية ذات العمليات المقطوعة. وهذا يمكن أن يضر باستعادة مورفولوجيا. بمجرد إتقانها ، يمكن الحصول على الاسترداد المورفولوجي للخلايا المملوءة بالسيتين الحيوي بشكل موثوق أثناء تسجيل مشبك التصحيح.

سيؤدي التنفيذ الناجح لتقنية التلوين المناعي التسلسلي إلى تحسين كفاءة استعادة البيانات وتسهيل توصيف الخلايا العصبية أثناء تسجيلات مشبك التصحيح القياسية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الاستخدام الفعال للخلايا المملوءة بالسيتين الحيوي لاستعادة مورفولوجيا الخلايا العصبية وتحديد العلامات الكيميائية العصبية.