تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة ⁺ خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ

الهدف العام من هذا الاختبار هو تعداد وتوصيف مجموعات الخلايا التائية الإيجابية CD8 الخاصة بفيروس نقص المناعة Simian الناتجة عن التطعيم أو العدوى الأولية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة الخلايا التائية ، مثل تواتر خلايا CD8 التائية الخاصة بالمستضد التي يتم إحداثها إما عن طريق التطعيم أو العدوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تحدد كمية الخلايا التائية CD8 الخاصة بالمستضد في العينات البيولوجية التي تم الحصول عليها مباشرة خارج الجسم الحي دون الحاجة إلى إعادة التحفيز في المختبر.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تقييم الخلايا التائية CD8 الخاصة بالشق في المكاك الريسوس ، ولدراسة استجابات الخلايا التائية CDB في بيئات مرضية متعددة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب المعرفة غير المكتملة المتاحة لعلم الوراثة لمكاك المكاك المعقد النسيجي الكبير ، ولأن تلطيخ قياس التدفق الخلوي يتطلب تطبيقا دقيقا للأجسام المضادة. ابدأ بإعادة تعليق الريسوس PBMC في وسط R10.

أضف 1.6 في 10 إلى الخلايا السابعة لكل تركيز مليلتر. Aliquot 50 ميكرولترا من الخلايا إلى العدد المناسب من أنابيب قياس التدفق الخلوي ، وأضف 50 ميكرولترا من مثبط بروتين كيناز إلى كل أنبوب. دوامة كل أنبوب واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

يجب تخفيف الكمية الصحيحة من رباعي الببتيد المعقد الكبير في مزيج رئيسي كاف لتلطيخ جميع الأنابيب التجريبية. لذلك ، من المهم إعداد 15٪ فائض من المزيج الرئيسي ، لحساب أخطاء السحب الماصة. أثناء احتضان الخلايا ، قم بتكسير مجاميع البروتين في محلول رباعي عن طريق الطرد المركزي ، لتقليل تلطيخ الخلفية.

بعد ذلك ، قم بتخفيف رباعيات التركيبات في مخزن مؤقت كاف للبقع ، بحيث يمكن إضافة 25 ميكرولترا من مزيج رباعي الترامير الرئيسي إلى كل أنبوب قياس التدفق الخلوي. ثم قم بدوامة أنابيب العينة واحتضان محاليل PBMC الرباعية في الظلام ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من مزيج التلوين الرئيسي إلى أنابيب العينة المناسبة.

واخلط الأنابيب للدوامة. بعد 25 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الخلايا بمحلول غسيل ، وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وصب المواد الطافية بعناية دون إزعاج الكريات. دوامة الخلايا في المخزن المؤقت المتبقي في كل أنبوب ، وقم بإصلاح العينات ب 250 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهايد لكل أنبوب.

دوامة على الفور واحتضان الأنابيب في الظلام ، عند 4 درجات مئوية. بعد 20 دقيقة ، اغسل الخلايا في محلول غسيل طازج. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وصب المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.

أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية ، والدوامة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام. ثم اغسل الخلايا وحبيبها. ثم صب المواد الطفية كما هو موضح سابقا.

انتقل إلى إضافة 50 ميكرولترا من مزيج البقع الرئيسي داخل الخلايا إلى الأنابيب المناسبة. دوامة كل عينة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد الانتهاء من الحضانة ، اغسل الخلايا وحبيبها.

العينات جاهزة الآن للحصول عليها في مقياس التدفق الخلوي. عادة ما ينتج عن رباعي Mamu-B017.01 تلطيخا خافتا ، والذي يمكن تحسينه بشكل كبير عن طريق المعالجة المسبقة للخلايا ، باستخدام مثبط بروتين كيناز. لتجنب تلطيخ الخلفية ، يجب تسمية الخلايا المتطابقة من الفئة الأولى من الفئة الأولى التي تحتوي أو لا تحتوي على مجموعة الخلايا التائية الإيجابية CD8 الخاصة بالمستضد ذات الأهمية ، ب tetramer ذي الصلة والتخفيفات المتعددة ، لتحديد الكمية المثلى التي تؤدي إلى أفضل فصل بين الخلايا التائية الإيجابية والسلبية CD8 الرباعي.

في هذه الرسوم البيانية ، يتم عرض استراتيجية البوابات المستخدمة لتحليل الحجم والنمط الظاهري للذاكرة لاستجابات الخلايا التائية الإيجابية الخاصة ب Gag CM9 الخاصة ب Gag CM9 في المكاك الريسوس الإيجابية Mamu-A 01. لاحظ أن مجموعة الخلايا التائية الإيجابية CD8 الإيجابية الرباعية ، مفصولة جيدا مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية. ومع تحديد مجموعات الذاكرة الفرعية بوضوح من خلال تعبير CD28 و CCR7 و Granzyme B داخل بوابة رباعي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إضافة الكواشف الصحيحة إلى كل مزيج رئيسي من الأجسام المضادة أو رباعي الرباعيات ، والعمل مع الأنابيب التجريبية في كل مرة كما هو موضح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف خصوصية ونمط ظاهري لخلايا CD8 التائية الخاصة بالمستضد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تلطيخ رباعي معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى في مقايسة نموذج المكاك الريسوس لأبحاث الإيدز البشري HIV-1. لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية من المكاك الريسوسية يتطلب احتياطات خاصة مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء معالجة العينة.