الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد واختبار حدود المجال المحتملة بسرعة داخل بروتينات الملف الملفوف الكبيرة لتحسين احتمالية العثور على جزء جوهري يتبلور. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على تبسيط عملية التبلور لبروتينات الملف الملفوف الكبيرة ، والتي من المعروف أنه يصعب تبلورها. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها تدمج كلا من الطرق التجريبية والحسابية لتحديد وفرز المرشحين المحتملين للتبلور بسرعة ، وبالتالي تحسين فرصهم في النجاح.

ستظهر هذه التقنية جينا زالوسكي ، طالبة دراسات عليا في مختبري ، وكيث أوكونور ، باحث جامعي في مختبري. للبدء ، اجمع بين المخرجات من الأدوات المستندة إلى الويب لإنشاء تنبؤات لحدود مجال الملف الملفوف المحتملة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد توليد بلازميدات التعبير واختبار مستويات التعبير الخاصة بها كما هو مفصل في النص ، ابدأ في تنقية كل سلالة عبرت بنجاح عن البروتين الموسوم ب Ruby.

لتحلل الخلايا ، قم أولا بإعادة تعليق كل حبيبات خلية مذابة في 1.5 مل من محلول التحلل الذي تم استكماله بمثبطات البروتياز. أضف 30 ميكرولترا من الليزوزيم بتركيز 10 ملليغرام لكل مليلتر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم صوتنة ، باتباع التعليمات الخاصة بالأداة المستخدمة. الطرد المركزي العينة في جهاز طرد مركزي منضدية لمدة 30 دقيقة عند 14 ، 000 مرة G لحبيبات المواد غير القابلة للذوبان أو الخلايا غير المحللة.

احفظ كل من المادة الطافية والحبيبات للتحليل اللاحق عبر SDS-PAGE. لإجراء تنقية تقارب النيكل ، قم أولا باحتضان 100 ميكرولتر من حبات NTA من النيكل ، مغسولة مسبقا في محلول التحلل مع المحلل القابل للذوبان لمدة خمس إلى 10 دقائق. اقلب التعليق عدة مرات لخلط الخرز.

الطرد المركزي العينة عند 800 مرة G لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي منضدي لتكسير الخرز. اتبع ذلك عن طريق غسل الحبيبات ثلاث إلى خمس مرات باستخدام محلول التحلل لتنظيف الملوثات غير المحددة. أخيرا ، قم بتصفية بروتين اندماج روبي من الخرز بمحلول التحلل ، مع استكمال إيميدازول مولاري واحد.

استخدم مقياس الطيف الضوئي المضبوطة على 280 نانومتر لقياس تركيز بروتين اندماج روبي ، ثم قم بتقييم تجانس العينة عن طريق تحميل واحد إلى خمسة ميكروغرام من بروتين الاندماج على هلام PAGE الأصلي. قم بتشغيل جل PAGE الأصلي بنسبة 10٪ عند أربع درجات مئوية لمدة 140 دقيقة عند 175 فولت. قم بتصوير الصفحة الأصلية باستخدام جهاز تصوير مجهز لتصور التألق ، مع ملاحظة المكان الذي يهاجر فيه الاندماج الموسوم بالروبي في هذا الفحص.

قم بإجراء تحلل بروتين محدود لتحديد المجالات المطوية بثبات عن طريق احتضان 95 ميكرولترا من اندماج Ruby-Shroom SD2 أولا بخمسة ميكرولترات من 0.025 Subtilisin A. أخذ عينات من التفاعل عند نقاط زمنية صفر ، 0.5 ، اثنان ، خمسة ، 15 ، 60 و 120 دقيقة ، وإزالة 10 ميكرولتر من التفاعل لكل نقطة زمنية وتصور تقدم التفاعل عبر SDS-PAGE باستخدام هلام أكريلاميد بنسبة 15٪. قم بتلطيخ الجل باللون الأزرق Coomassie لتقييم ما إذا كان يمكن تحديد الأنواع المقاومة للبروتياز. قم بدمج البيانات من كفاءة التنقية والسلوك في PAGE الأصلي والتحلل البروتيني المحدود على بروتينات اندماج mRuby2-Shroom المنقاة جزئيا في تقييم شامل للسلوك العام لهذه البروتينات في المحلول.

قم بإجراء تعبيرات واسعة النطاق باستخدام مزارعين لترين من mRuby2-Shroom SD2 بهدف تحقيق خمسة إلى 20 ملليغرام من العينة المنقاة بالكامل. بعد نمو الخلية ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 8 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق. يمكن تخزين حبيبات الخلية الناتجة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة.

بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في حوالي ثمانية ملليلتر من محلول التحلل لكل جرام من حبيبات الخلايا المجمدة. قم بتحليل الخلايا المعاد تعليقها باستخدام الخالط. بعد تحلل الخلية ، قم بتكسير الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي عند 30 ، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بربط الدفعة الجزء القابل للذوبان باستخدام 10 ملليلتر من راتنج NTA من النيكل المغسول مسبقا. صب معلق الخرزة في عمود جاذبية مناسب والسماح للبروتينات غير المرتبطة بالتصريف ، ثم اغسل الراتنج ثلاث إلى خمس مرات باستخدام 40 مل من محلول التحلل ، متبوعا بغسل مع محلول تحلل مكمل بكلوريد الصوديوم المولاري. قم بإجراء غسيل نهائي للراتنج باستخدام 40 مل من محلول التحلل المكمل ب 80 مللي مولار.

قم بإزالة بروتين اندماج Ruby-Shroom ب 40 مل من محلول التحلل الذي يحتوي على إيميدازول مولاري واحد. قم بتجزئة البروتين الملوطوف يدويا إلى أربعة إلى 10 أجزاء ملليلتر. تأكد من الكسور التي تحتوي على بروتين اندماج Ruby-Shroom باستخدام جل SDS-PAGE بنسبة 10٪.

أضف ملليغراما واحدا من بروتياز TEV لكل 25 إلى 50 ملليغرام من بروتين الانصهار لإزالة علامة روبي. بعد ذلك ، قم بغسيل الكسور المناسبة في مخزن مؤقت للانقسام TEV باستخدام ستة إلى ثمانية كيلو دالتون من أنابيب غسيل الكلى ذات الوزن الجزيئي. غسيل البروتين بالكلى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع التحريك البطيء.

بعد غسيل الكلى ، كرر خطوات تنقية تقارب النيكل. يجب أن يتدفق مجال Shroom-SD2 إلى الجزء غير المرتبط بينما تظل علامة Ruby مرتبطة بالراتنج. باستخدام مكثف الدوران ، ركز كسور الذروة إلى حوالي 10 ملليغرام لكل مليلتر ، ثم قم بإجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لتحليل كسور الذروة عبر هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪.

بعد تجميع أجزاء الذروة ، قم بتحويل المحلول إلى مخزن مؤقت للبلورة ، ثم قم بتركيز البروتين المحلل إلى 10 ملليغرام لكل مليلتر قبل التبلور. قم بفحص مجموعة صغيرة من 12 حالة لتحديد تركيز البروتين الأمثل لتجارب التبلور باستخدام 24 صينية تبلور قطرة جيدة. إجراء تجارب التبلور باستخدام طريقة انتشار البخار.

أولا ، قم بتقطيع 500 ميكرولتر من كل حالة من الحالات ال 12 في آبار منفصلة. على كل قاعدة ، قم بعمل قطرات تحتوي على ميكرولتر واحد من محلول البئر وميكرولتر واحد من عينة البروتين. أغلق الدرج بسرعة بشريط شفاف ، ثم انقل الدرج إلى بيئة مناسبة يتم التحكم في درجة حرارتها وخالية من الاهتزاز.

افحص القطرات الموجودة في الصواني خلال الأيام الثلاثة المقبلة باستخدام مجهر بتكبير يصل إلى 100 مرة. في نهاية فترة الأيام الثلاثة ، قم بتسجيل كل قطرة على أنها لا تحتوي على هطول أمطار أو هطول أمطار خفيفة أو هطول أمطار غزيرة أو بلورات. يجب ألا يحتوي تركيز البروتين المناسب على أكثر من ستة هطول أمطار غزيرة.

باستخدام تركيز البروتين المحدد ، قم بفحص مجموعة واسعة من شاشات التبلور المتاحة تجاريا. يؤدي استخدام روبوت معالجة السوائل أو البلورة إلى تسريع هذه العملية بشكل كبير مع تقليل الخطأ في القطرات. يتطلب بروتينا أقل بكثير ، مما يسمح للمستخدم بفحص المزيد من الحالات بعينة واحدة.

قم بتحسين الظروف الأولية المحددة من الشاشات العريضة عن طريق التغيير المنهجي لكل متغير من المتغيرات داخل قطرة التبلور باستخدام 24 صينية شاشة بئر ، كما كان من قبل. يستخدم تحلل البروتين المحدود لتحديد مناطق البروتين التي قد تكون مرنة أو أكثر سهولة للبروتياز. يظهر هنا نمط تدهور لمجال SD2 حساس من الناحية البروتينية ، وآخر مستقر تماما.

تم إجراء تحلل البروتين المحدود في سياق بروتينات اندماج الياقوت. في هذه الحالة ، تم انشقاق تسلسل الرابط بين Ruby ومجال SD2 بسرعة ، كما هو متوقع ، لكن شظايا Ruby و SD2 الناتجة ظلت مستقرة إلى حد كبير. يمكن أن يكشف التحليل بواسطة PAGE الأصلي بسرعة عن مرشحين جيدين للتبلور.

تم تشغيل أربعة مجمعات Shroom-Rock مع بطاريات بروتينية مختلفة على المواد الهلامية PAGE الأصلية. كان للمركب الذي يحتوي على الصخور من 834 إلى 913 أفضل سلوك وتبلور بسهولة ، في حين أن الآخرين يتبلور فقط عند التحلل أو فشلوا في التبلور تماما. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير مجموعة من حدود المجال المحتملة لبروتين الملف الملفوف الكبير وكيفية استخدام نظام روبي لتحديد أفضل المرشحين للتبلور بسرعة وسرعة.

بينما يظل علم البلورات مسعى يستغرق وقتا طويلا ، فإن استخدام هذه التقنية سيركز بحثك عن البروتينات التي ستتبلور باستخدام فحوصات مباشرة لإزالة المرشحين الفقراء ، مما يسمح لك بقضاء المزيد من الوقت على المرشحين الذين لديهم آفاق أفضل للنجاح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر تضمين أكبر قدر ممكن من المعلومات عند تحديد حدود المجال المحتملة. ستختلف المعلومات التي تختارها عند استخدام هذا الإجراء لكل بروتين.

إذا كان ذلك ممكنا ، يجب إجراء طرق أخرى ، مثل المقايسات القائمة على الخلايا أو الكيميائية الحيوية ، للتأكد من أن شظايا البروتين المعنية لا تزال تحتوي على وظيفة ذات أهمية بيولوجية. على الرغم من أن هذه الطريقة تركز على بروتينات الملف الملفوف ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف الإطار العام مع أي بروتين تقريبا. لا تنس أن العمل مع بعض الأجهزة والكواشف البيولوجية يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما اتباع الاحتياطات ، مثل استخدام القفازات أو ارتداء النظارات الواقية ، عند تنفيذ هذا الإجراء.