تحليل الحركية من انقسام الخلايا والتوسع: تحديد مقدار الأساس الخلوي للمناطق التنموية النمو وأخذ العينات في ذرة شامية أوراق

تتمثل الأهداف العامة لهذا التحليل في تحديد الأساس الخلوي لنمو أوراق الذرة ، واستخدام هذه البيانات للتحقيق في الآليات التنظيمية للنمو الجزيئي من خلال تنفيذ استراتيجيات أخذ العينات التنموية الخاصة بالمرحلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة سؤال رئيسي في بيولوجيا نمو النبات. كيف يساهم انقسام الخلايا وتمدد الخلايا في الاختلافات في نمو العضو بأكمله؟

يسمح هذا النهج بالتحقيق ورسم الخرائط المكانية للعمليات الجزيئية والفسيولوجية الكيميائية الحيوية ، والتي تكمن وراء نمو عضو النبات بأكمله. على الرغم من أن هذا النظام يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة لنمو أوراق الذرة ، إلا أنه يمكن استخدام هذه التقنية لأنظمة أخرى. بما في ذلك أنواع الحشائش الأخرى والأعضاء.

المرئي لهذه الأساليب أمر بالغ الأهمية. عند الحصاد ، يصعب تنفيذ خطوات القياس والقياس بدون هذا العرض التوضيحي. وسيتم توضيح الإجراء كاترين سبرانجرز وفيكتوريا أفراموفا.

طالبان دكتوراه من مختبري. لإجراء تحليل كيميائي كامل لنمو الأوراق في أحادي الفلقة ، قم بزراعة ما لا يقل عن 15 نباتا لكل معالجة ونمط وراثي ، في ظل ظروف خاضعة للرقابة في غرفة النمو. عندما تظهر ورقة ذات أهمية ، استخدم مسطرة لقياس طول الورقة ، أي الطول من التربة إلى طرف الورقة ، يوميا حتى تتمدد الورقة بالكامل.

في مرحلة التطور ذات الأهمية ، قم بقص الجزء الموجود فوق سطح الأرض من النبات من خمسة نباتات تمثيلية على الأقل بالقرب من الجذور قدر الإمكان ، للحفاظ على المنطقة الإنشائية سليمة. بعد ذلك ، بدءا من الأوراق الخارجية ، قم بفتح جميع الأوراق برفق حتى الورقة محل الاهتمام ، واحدة تلو الأخرى. إزالة بضعة ملليمترات إضافية من القاعدة لفصل الأوراق حسب الضرورة.

بعد ذلك ، قم بإزالة القمة والأوراق الصغيرة المحاطة بالورقة ذات الأهمية ، وقم بقص جزء يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات من الورقة ، بدءا من القاعدة على جانب واحد من منتصف الوريد. من الأهمية بمكان قطع الورقة في المكان الذي تتصل فيه بالساق. نظرا لأن القطع إلى ارتفاع ، سيؤدي إلى تقدير أقل من حجم النسيج الإنشاء.

قم بتخزين الجزء في أنبوب اختبار سعة 1.5 مليلتر ، مملوء بثلاثة محلول حمض الإيثانول الخليك المطلق بحجم واحد ، عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة حتى عدة أشهر. من الجانب الآخر من الوريد ، قم بقطع جزء 11 سم من القاعدة ، وقم بتخزين هذا الجزء في أنبوب سعة 15 مليلتر مملوء بالإيثانول المطلق ، عند أربع درجات مئوية لمدة ست ساعات على الأقل لإزالة الأصباغ. بعد جولة ثانية لمدة 24 ساعة في الإيثانول المطلق عند أربع درجات مئوية ، استبدل الإيثانول بحمض اللاكتيك النقي ، وقم بتخزين الجزء عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة أخرى ، أو حتى مزيد من التحليل.

لقياس النسيج الإنشائي ، قم أولا بنقل جزء الأوراق المكون من ثلاثة سنتيمترات إلى مخزن شطف معد حديثا لمدة 20 دقيقة. في نهاية الحضانة ، انقل الجزء إلى وعاء من محلول تلطيخ دابي ، لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق على الجليد في الظلام. بعد ذلك ، قم بتركيب الأنسجة بسرعة على شريحة مجهر زجاجي ، وقم بتغطية الجزء بغطاء زجاجي.

تأكد من تألق خلايا البشرة تحت المجهر باستخدام مضان الأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك ، قم بتركيب العينة في قطرة من عازلة الشطف على شريحة مجهر جديدة بغطاء زجاجي جديد. باستخدام تكبير 20 مرة ، أعد المقطع إلى المجهر ، وقم بالتمرير عبر العينة لتحديد الأشكال الانقسامية التكاثرية.

تجنب أي انقسام خلوي تكويني للجذع النامي ، ثم حدد مكان وجود الشكل الانقسامي الأبعد. باستخدام برنامج تحليل الصور ، قم بقياس الطول الكامل لإطار الصورة. في هذا المثال، 645 ميكرومتر.

ثم احسب عدد الإطارات التي تغطي طول النسيج الإنشائي الكامل من الشكل الانقسامي البعيد إلى قاعدة الورقة ، واضرب هذا الرقم في طول إطار واحد للحصول على طول النسيج الإنشائي الكامل. للحصول على ملف تعريف طول الخلية ، انقل الجزء الذي يبلغ طوله 11 سم من حمض اللاكتيك إلى المقعد ، واستخدم مشرطا لتقطيع الأنسجة إلى 10 أجزاء بحجم سنتيمتر واحد. قم بتركيب شرائح الأوراق الناتجة على شريحة مجهرية واحدة ، وقطرة صغيرة من حمض اللاكتيك.

وضع كل القطع مع نفس الجانب لأعلى. وبعد ذلك ، انقل الشريحة تحت مجهر مزود ببصريات تباين التداخل التفاضلي. بدءا من الجزء الأقرب إلى قاعدة الورقة ، استخدم برنامجا مناسبا لتحليل الصور لقياس طول ما لا يقل عن 20 خلية وملفات بشرة مكررة مجاورة مباشرة للملفات الجذعية ، لضمان الاختيار المتسق لنفس نوع الخلية في مواضع متباعدة بشكل متساو على طول كل جزء من المقطع.

خذ هو تحديد الموضع المقابل لكل قياس في جميع أنحاء الورقة. ثم حدد متوسط طول الخلية عند كل ملليمتر على طول محور الورقة باستخدام إجراء تجانس محلي متعدد الحدود يتم تنفيذه في البرنامج النصي R المتاح كملف تكميلي واحد. احرص على عدم الإفراط في النعومة.

يجب أن يزيل التنعيم الضوضاء في بيانات الخلية ، ولكن لا يؤثر على الشكل العام للمنحنى. هنا ، تظهر مقارنة بين النباتات التي تسقى جيدا والنباتات المعرضة لظروف إجهاد الجفاف من حيث نمو أوراقها. كان طول الورقة النهائي للنباتات الضابطة أقل بنسبة 40 في المائة من طول النباتات المجهدة للجفاف ، بسبب انخفاض معدل استطالة الأوراق.

معدل استطالة الأوراق للنباتات المجهدة بالجفاف ، أقل بنسبة 73 في المائة من معدل الضوابط المروية جيدا ، بسبب انخفاض إنتاج الخلايا. وهو ما يحدث في الخرشنة بشكل أساسي بسبب انخفاض معدل انقسام الخلايا. يوفر التحليل الحركي خريطة لتوطين منطقة نمو الأوراق ، مما يسمح بأخذ العينات بدقة دون المنطقة للتحليل الجزيئي والكيميائي الحيوي.

على سبيل المثال ، يوضح القياس الكمي لMDA على طول منطقة نمو أوراق الذرة في النبات الخاضع للتحكم في الري الجيد وظروف الجفاف ، زيادة كبيرة في هذا المنتج من انهيار الدهون في جميع أنحاء منطقة النمو استجابة لظروف حجب المياه. بسبب تقصير الأوراق استجابة للجفاف ، لم تتوافق مناطق النمو في التحكم وفي النباتات المجهدة في هذه التجربة. ومع ذلك ، باستخدام ملف تعريف طول الخلية ، يمكن تحديد طول مناطق النمو ، مما يسمح بمقارنة مستويات MDA في المناطق الفردية.

بمجرد إتقانها ، يمكن معالجة عينة واحدة في أربع ساعات ، إذا تم تنفيذ التقنية بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على النسيج الإنشائي سليما أثناء الحصاد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق تقنيات أخرى ، مثل تحديد المعلمات الجزيئية والكيميائية الحيوية ، لدراسة مشاركتها في تنظيم النمو.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد انقسام الخلايا وتمدد الخلايا في زراعة أوراق الذرة ، وتحديد حجم مناطق النمو المختلفة ، وتفسير البيانات الجزيئية والكيميائية الحيوية وفقا لذلك. لا تنس أن العمل مع أحماض اللاكتيك والخليك ، و EDTA يمكن أن يكون خطيرا. لذلك ، يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وتنظيف المجهر في كل مرحلة بعد الاستخدام عند تنفيذ هذا الإجراء.