عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة ذبابة الفاكهة اليرقات الزحف السلوك

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مرحلة اليرقات ذبابة الفاكهة تزحف في قناة الاغاروز الخطية لدراسة تطور الدوائر العصبية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم السلوك العصبي وعلم الأحياء التنموي ، مثل فهم الرموز العصبية التي تولد أنماطا حركية وتحديد العمليات الجينية والخلوية الرئيسية التي تحدد نطاق الدوائر العصبية للتحكم في الحركة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقيد ذخيرة سلوك اليرقات حتى يتمكن الباحثون من دراسة نمط واحد متعدد بالتفصيل.

الإجراء زاريون مارشال ، فني من مختبري. أولا ، من المهم تقييم صحة اليرقة. قبل ثلاثة إلى أربعة أيام من التسجيل ، استبدل لوحة التجميع الخاصة بالقفص البالغ.

تابع القيام بذلك يوميا وفي نفس الوقت من اليوم. عد البيض واليرقات حديثة الفقس على الطبق. يتراوح العدد المتوقع للبيضات بين 500 و 2000.

اضبط عدد البالغين في القفص حسب الحاجة. نقوم بفحص اللوحة بعد 24 ساعة لتحديد ما إذا كانت اليرقات سليمة. يجب أن يكون معظم البيض قد فقس في يرقات ، ويجب أن تكون اليرقات قد زحفت إلى عجينة الخميرة.

تشمل علامات سوء الصحة عددا كبيرا من البيض غير المفرغ ، وأجسام اليرقات الميتة بعيدا عن معجون الخميرة ، واليرقات ذات البقع الداكنة بشكل غير عادي في البطن وهو مؤشر على رد فعل مناعي. إذا بدت اليرقات غير صحية ، فقم بتغيير القفص باستخدام ألواح معدة حديثا ، وتحقق من النمط الجيني للبالغين. للتجربة ، اجمع يرقات الطور الثاني حديثة الفقس من صفائح عمرها يوم إلى يومين.

يمكن استخدام كل هذه المراحل في التحليل. بالنسبة لهذا البروتوكول ، لديك قالب صب PDMS ذو قناة خطية. نظف قالب الصب بكحول الأيزوبروبيل.

بمجرد أن يجف ، ضع القالب في غطاء طوله عشرة سنتيمترات أو وعاء مشابه. ثم املأ القالب بثلاثة بالمائة من الاغاروز المبرد إلى 55 درجة مئوية. صب الاغاروز بعناية لتجنب حبس فقاعات الهواء في القالب.

يجب تغطية القالب فقط بواسطة الاغاروز. بمجرد التصلب ، قم بإزالة قنوات الاغاروز من القالب. قم بقص حواف القنوات على شكل قرص ، ثم اغمر القنوات في الماء.

يمكن تخزينها في الماء عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى سبعة أيام. قبل استخدام القنوات ، اتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة. حدد قناة تطابق عرض اليرقة.

يتراوح عرض القنوات من 100 إلى 300 ميكرون ويبلغ عمقها 150 ميكرون. ثم استخدم شفرة حلاقة نظيفة لقطع قناة واحدة من القرص المعد. باستخدام الملقط ، انقل القناة إلى غطاء زجاجي بحجم مناسب أو انزلق مع الجانب المحزز لأعلى.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا دقيقا لالتقاط اليرقة برفق دون الضغط عليها. تعمل فرشاة الرسم ذات الرؤوس الدقيقة أيضا بشكل جيد. في حالة الضغط ، قد تهيمن ردود أفعال الألم مثل التدحرج أو الانحناء على سلوك اليرقة في القناة.

الآن اغسل اليرقة عن طريق غمرها لفترة وجيزة في الماء ، ثم ضعها في القناة المقطوعة برفق في موضعها. بمجرد دخولك إلى القناة ، اضبط اتجاه اليرقة لتسهيل تصوير الهيكل المهم. ثم ضع قطرة أو قطرتين من الماء في طرفي القناة لملء القناة بالماء.

إذا تم احتجاز أي فقاعات هواء ، ارفع جوانب القناة برفق لإزالتها. لضبط اتجاه اليرقة بشكل أكبر ، ادفع القناة برفق لدحرجة اليرقة حولها. اليرقة جاهزة الآن للتصوير.

تؤدي اليرقات في القنوات الخطية نوبات مستمرة من الزحف الإيقاعي. يتم فحص مجسات الفلورسنت بسهولة. على سبيل المثال ، تظهر اليرقات التي تعبر عن GFP في الخلايا العصبية من سائق GAL4 تغيرات ديناميكية في شدة الفلورسنت المنبعثة من الحبل العصبي أثناء دورة الزحف.

يتحرك الجهاز العصبي المركزي للأمام في نفس الوقت تقريبا الذي يتحرك فيه رأس اليرقات والذيل حيث تمر موجة من تقلص العضلات على طول محور الجسم ، ويتحرك الجهاز العصبي المركزي داخل وخارج مستوى التركيز ، مما يتسبب في تغيير مضان الحبل العصبي. تم تحديد التغيرات في التألق من ثلاث خطوات زحف لثلاث يرقات. اتبعت ديناميكيات مضان الحبل العصبي خلال دورة الخطوة نمطا قادرا على التكاثر يمكن استخدامه للتنميط الظاهري.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية جمع اليرقات للسلوك ، وإعداد قنوات الاغاروز ، وتحميل اليرقات في القنوات لتصور سلوك الزحف الخطي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع اليرقات برفق.