تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجميع وعاء استزراع مستمر ، حيث يمكن قياس الاستجابة لإضاءة الميكروبات البصرية الوراثية بالمجهر تلقائيا في الوقت الفعلي وعلى مدار عدة أيام. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الخلوية وهندسة التمثيل الغذائي ، مثل كيف يمكن للتعبير الجيني الديناميكي أن يثير استجابات تختلف عن التعبير الجيني الثابت. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الثقافة المستمرة تمكن من جمع القياسات لعدة أيام.

للبدء ، قم بلحام الخط الأرضي وخط البيانات وخط الجهد الموجب لمقياس الحرارة الرقمي إلى لوحة الدوائر المطبوعة. قم بقص دبوس واحد من رأس أنثى ثلاثي دبابيس وقم بقص الدبابيس المتبقية. قم بلحام هذا في زوج من الثقوب المسمى R2 ، وقم بتوصيل الدبابيس الملحومة عن طريق إدخال مقاوم 4.7 كيلو أوم في رأس الدبوس.

بعد ذلك ، قم بتوصيل المكونات المتبقية بلوحة الدائرة. تراكب لوحة الدائرة على وحدة التحكم الدقيقة. قم بإعداد حاوية مقاومة للضوء، وقم بتثبيت جميع البرامج كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

أولا ، ضع الطرف الطويل لمنفذ الألومنيوم من خلال الحشية في وعاء الاستزراع وقم بربط الغطاء. قم بتغطية منفذ منفذ ألومنيوم قصير بأنابيب سيليكون متوسطة القطر. قم بتوصيل طرف التقطير عن طريق إدخال قفل لور أنثوي ، ثم توصيل قابس قفل لورير ذكر.

هذا المنفذ تكميلي ولن يتم استخدامه. قم بتوصيل جزأين قصيرين من أنابيب السيليكون متوسطة القطر بأقفال لور من الذكور والإناث. ثم قم بتوصيل أحد طرفيه بمأخذ منفذ قصير من الألومنيوم ، وقم بتوصيل طرف التقطير.

سيتم تلقيح الوعاء من خلال هذا الأنبوب. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوبين متوسطين بنهايات الأنابيب والتمعجية ذات القطر المتوسط والموصلات. قم بتوصيل أحد الطرفين بمنفذ قصير من الألومنيوم ، وقم بتوصيل الطرف الآخر.

في وقت لاحق ، سيتم توصيل هذا بقارورة الوسائط. قم بتوصيل أنبوب سيليكون متوسط القطر بأطول منفذ من الألومنيوم. يجب أن يكون الأنبوب طويلا بما يكفي للوصول إلى قارورة الوسائط.

قم بتوصيل جزء قصير آخر بطول بضع بوصات حتى النهاية ، ثم أدخله في السدادة المطاطية على قارورة الوسائط. المشبك الأنبوب. عند فك التثبيت لاحقا ، يسمح هذا الاتصال بخلط الثقافة وتهويتها والحفاظ عليها في ضغط إيجابي بواسطة الفقاعات الواردة.

أدخل أنبوبا متوسط القطر طويلا بما يكفي للوصول إلى قاع القارورة في السدادة التي سيتم من خلالها نقل الوسائط. قم بتوصيل أنبوب آخر متوسط القطر بهذا الأنبوب ، ثم أنبوب بقطر عريض في النهاية. قم بتوصيل نهاية التقطير.

املأ الفتحة الثالثة في السدادة بجزء قصير من الأنابيب ذات القطر المتوسط ، متصلة بجزأين آخرين من الأنابيب ذات القطر المتوسط ، ويتم توصيلها في نهاية التقطير. سيتم توصيل هذا بمضخة تفريغ ، وبعد ذلك بمضخة حوض السمك. أدخل قفل لور ذكر في جزء من أنابيب السيليكون ذات القطر الضيق ثم أدخل أنابيب PTFE بإحكام.

ثم قم بإرفاق قفل لور أنثوي بأنبوب متوسط القطر. قم بربط القفل الأنثوي على طول أنبوب PTFE لتوصيل الأقفال والآخر بمنفذ قصير من الألومنيوم. تأكد من أن أنبوب PTFE داخل وعاء الاستزراع يتدلى أسفل ثاني أطول أنبوب ألومنيوم ، وفوق القاع.

تقليم حسب الحاجة. سيتم أخذ عينات من الوسائط من هنا إلى قناة التصوير ، ويقلل الأنبوب الضيق من الحجم المتوسط. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب السيليكون الضيق المكشوف بالأنبوب التمعجي الضيق والموصلات.

لهذا قم بتوصيل ثلاثة أجزاء من الأنابيب ذات القطر الضيق وجزأين من أنابيب PTFE ، بالتناوب. قم بتوصيله بقارورة النفايات السائلة ، عبر أنابيب ذات قطر متوسط. ثم قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب السيليكون متوسط القطر بثاني أطول أنبوب لمنفذ الألومنيوم في الطرف الآخر من قارورة النفايات السائلة.

يحدد أنبوب الألمنيوم هذا حجم الثقافة ، وتتدفق الثقافة الزائدة في حاوية النفايات السائلة. لف أغطية القارورة بورق الألمنيوم ، ثم قم بتعقيم التجميع لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة. قم بتوصيل مرشح التفريغ بزجاجة سعة 100 مل.

قم بإزالة غطاء الحلمة ، ثم قم بإزالة السدادة البيضاء من حلمة مرشح التفريغ باستخدام ملاقط معقمة. قم بتوصيل أنبوب السيليكون العريض بالحلمة ، والأنبوب الحر الآخر لقارورة الوسائط بمضخة تفريغ ، وتأكد من إغلاق الأنبوب الثالث الذي يربط قارورة الوسائط بوعاء الاستزراع. املأ الفلتر بالوسائط ، وقم بتشغيل مضخة التفريغ ، ثم قم بتصفية بقية الوسائط.

قم بتثبيت أنبوب السيليكون المتوسط المتصل بالمكنسة الكهربائية وقم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ. قم بإزالة الألواح من الجزء الوسيط من أنابيب السيليكون المتوسطة المتصلة بمضخة التفريغ وأدخل الطرف الأزرق لفلتر هواء حقنة معقمة في هذا الأنبوب. ثم قم بتثبيت أنبوب السيليكون العريض وافصل لوير الذكر عنه.

افصل القابس عن اللوير الأنثوي لأنبوب مدخل وسائط وعاء الزراعة. قم بتوصيل هذه السحر لتمكين ضخ الوسائط في وعاء الاستزراع. ثم قم بإزالة الفلتر من زجاجة 100 مل ، وقم بتوصيل غطاء الزجاجة.

استخدم هذه الوسائط لإعداد ثقافة بداية. اضبط مجموعة الاستزراع المستمرة بالقرب من المجهر مع قارورة الوسائط أعلى من وعاء الاستزراع ، وقارورة النفايات السائلة أقل من وعاء الزراعة لمنع التدفق العكسي. قم بلصق السدادات المطاطية بإحكام على الوسائط وقوارير النفايات السائلة.

بعد ذلك ، افصل نهايات أنبوب PTFE من أنبوب السيليكون الضيق الذي يربطها وقم بتوصيل هذه الأطراف بمدخل ومخرج جهاز الموائع الدقيقة المعد. ثم ادفع الوسائط إلى وعاء الاستزراع ، عن طريق توصيل الطرف الأبيض لفلتر هواء المحقنة بمضخة الحوض. عندما تصل الوسائط إلى مستوى منفذ النفايات السائلة ، قم بلف أنابيب مدخل الوسائط المتوسطة والموصلات حول المضخة التمعجية البطيئة ، وأنابيب مخرج العينة الضيقة والموصلات حول المضخة التمعجية السريعة.

قم بتهوية الوسائط عن طريق فك أنبوب الهواء بين قارورة الوسائط ووعاء الاستزراع. بعد ذلك ، قم بلصق وسادة التسخين ومقياس الحرارة على وعاء الزراعة بحيث يمكن التحكم في درجة حرارته. قم بلف أنابيب الوسائط حول وعاء الاستزراع ، بحيث تكون الوسائط الداخلة في نفس درجة حرارة الوعاء.

ثم أدخل وعاء الاستزراع في حاوية الرغوة السوداء فوق مصفوفة LED وتأكد من عدم ضغط الأنابيب. استخدم المكون الإضافي لوحدة التحكم في المفاعل الحيوي لضبط مضخة الوسائط البطيئة لمدة عشر كل فاصل زمني مدته 30 ثانية. سيكون معدل التدفق منخفضا جدا ، ولكنه أكبر من معدل التبخر.

قم بتثبيت أنبوب الهواء الوارد بين قارورة الوسائط ووعاء الزراعة. استخدم ماصة لتلقيح وعاء الاستزراع بملليلتر واحد من ثقافة بادئ. ثم قم بتثبيت نهاية التقطير لهذا الأنبوب ، وفك أنبوب الهواء.

دع الثقافة تنمو بين عشية وضحاها. قم بتغطية العلبة حتى لا يدخل الضوء. في اليوم التالي ، استخدم المكون الإضافي لوحدة التحكم في المفاعل الحيوي لضبط المضخات التمعجية على الدوران لنسبة أكبر من الوقت ، بما يتوافق مع الوسائط المطلوبة ومعدلات تدفق أخذ العينات.

دع كثافة الثقافة تتوازن بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، املأ قائمة مواقع المسرح والمدير الصغير بمجموعة من المواضع غير المتداخلة حيث ستكون الخلايا التي يتم ضخها في قناة الموائع الدقيقة في المستوى البؤري. ثم افتح المكون الإضافي لوحدة تحكم المفاعل الحيوي.

حدد الدورة التدريبية الزمنية لمصفوفة LED المطلوبة وقنوات التصوير والإعدادات التجريبية الأخرى من المطالبات، ثم ابدأ في جمع البيانات. تم استخدام هذا الجهاز لتحفيز ثقافة الخميرة الكريمة ، للتعبير عن البروتين الفلوري الأصفر استجابة للضوء الأزرق عبر نظام نسخ بصري محفز. تم الحصول على تباين أساسي وصور فلورية لقناة الموائع الدقيقة.

تم تحديد الخطوط العريضة للخلية من صور تباين الطور ، وتم تعيينها إلى صور الفلورسنت ، وتم تسجيل صور الفلورسنت في الوقت الفعلي. توضح الخريطة الحرارية هنا التوزيع الفلوري للثقافة بسبب إنتاج البروتين الفلوري الأصفر عند تنشيط نظام البصريات الوراثية. تم تحليل تألق ما يقرب من 170،000 خلية من أكثر من 30،000 صورة ، تم الحصول عليها من 28 موقعا مرحليا على مدار 70 ساعة.

خلال هذه الدراسة ، تعرضت الثقافة لكثافة متفاوتة من الضوء الأزرق لمدة ست ساعات ، تليها ست ساعات من الظلام الدامس. تعرضت الخلايا للضوء قبل القياس الأول وهذا هو السبب في أن شدة التألق تتناقص خلال الفترة المظلمة الأولى. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثماني ساعات ، على مدار ثلاثة أيام ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا استخدام تقنية معقمة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل التحكم في التغذية الراجعة في الوقت الفعلي ، للتحكم في تركيز البروتين. ستمكن هذه التقنية الكائنات الحية ذات التركيبات البصرية الوراثية من الدراسة ديناميكيا ، على مدى فترات زمنية أطول ، لفترة أطول مما هو ممكن باستخدام الألواح أو زراعة الدفعات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دمج جهاز استزراع مستمر ، وضوء ، ومجهر ، لتحفيز ودراسة الميكروبات البصرية الوراثية.