السريع العصبية تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على المصفوفات الدقيقة الكهربائي

الهدف العام من بروتوكول التمايز العصبي هذا هو إنشاء شبكات عصبية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان والتي تنمو على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة بطريقة سريعة وخاضعة للرقابة. يمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأعصاب. يمكن استخدامه لدراسة الآليات البيولوجية الكامنة وراء الاضطرابات العصبية ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لمعالجة الأسئلة العصبية الحيوية الأساسية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التمايز السريع للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا عصبية بطريقة خاضعة للرقابة. في اليوم الأول ، قم بتسخين DMEM / F12 و CDS و E8 مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف الدوكسيسيكلين إلى وسط E8 لعمل تركيز نهائي يبلغ أربعة ميكروغرام لكل مليلتر ثم أضف مثبط الصخور إلى الخليط.

استنشق الوسط المستهلك من RTTANGN2 hiPSCs الإيجابية وأضف ملليلتر واحد من CDS إلى الخلايا. بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. تحت المجهر ، تحقق مما إذا كانت الخلايا تنفصل عن بعضها البعض.

ثم أضف ملليلترين من DMEM / F12 في البئر. قم بتعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة سعة 1 ، 000 ميكرولتر ، ثم انقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. بعد ذلك ، أضف سبعة ملليلتر من DMEM / F12 إلى تعليق الخلية ، وقم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة خمس دقائق.

بعد خمس دقائق ، استنشق المادة الطافية وأضف ملليلترين من وسط E8 المحضر. قم بفصل hiPSCs عن طريق وضع طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر على جانب الأنبوب سعة 15 ملليلتر وإعادة تعليق الخلايا برفق. تحت المجهر ، تحقق مما إذا كانت الخلايا منفصلة.

ثم حدد عدد الخلايا لكل مليلتر باستخدام مقياس كثافة الدم. بالنسبة للبئر الستة MEAs ، قم بتخفيف الخلايا للحصول على تعليق خلوي 7.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. بالنسبة لزلات الغطاء ، قم بتخفيف الخلايا للحصول على تعليق خلوي أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر.

استنشق اللامينين المخفف من زلات الغطاء والبئر الستة MEAs. بالنسبة للبئر الستة MEAs ، قم بإضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى منطقة القطب النشط في كل بئر. ثم قم بلوحة الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 24 بئر.

بعد ذلك ، ضع ستة بئر MEAs أو صفيحة 24 بئر في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية. بعد ساعتين ، أضف بعناية 500 ميكرولتر من وسط E8 المحضر إلى كل بئر من المتوسطات المتوسطة الستة للآبار. بعد ذلك ، ضع الآبار الستة MEAs طوال الليل في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

في اليوم الثالث ، قم بتسخين 0.05٪ Trypsin-EDTA إلى درجة حرارة الغرفة. DPBS دافئ و DMEM / F12 مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين حتى 37 درجة مئوية. ثم استنشق الوسط المستهلك لثقافة الخلايا النجمية للفئران.

اغسل المزرعة بإضافة خمسة ملليلتر من DPBS وحركها برفق. بعد ذلك ، استنشق DPBS وأضف خمسة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA. حفي التربسين EDTA برفق.

ثم احتضان الخلايا في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، تحقق تحت المجهر لفحص ما إذا كانت الخلايا منفصلة. افصل الخلايا الأخيرة عن طريق ضرب القارورة عدة مرات.

ثم أضف خمسة ملليلتر من DMEM / F12 إلى القارورة. حاول تقييم الخلايا برفق داخل القارورة باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك ، اجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 15 مل.

قم بتدوير الأنبوب عند 200 × جم لمدة ثماني دقائق. بعد ذلك ، استنشق الفوق ، وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من DMEM / F12. حدد عدد الخلايا لكل مليلتر باستخدام مقياس كثافة الدم.

بعد ذلك ، أضف 7.5 في 10 إلى الخلايا النجمية الرابعة إلى كل بئر من المتوسطات المتوسطة المتوسط الستة للآبار. وأضف اثنين في 10 إلى الخلايا النجمية الرابعة إلى كل بئر من صفيحة 24 بئر. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة رطبة بزاوية 37 درجة مئوية.

احصل على البيانات عند تضخيم 1 ، 200 مرة ، وأخذ عينات من الإشارة عند 10 كيلو هرتز باستخدام بطاقة الحصول على بيانات MCS. سجل 20 دقيقة من النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية المشتقة من hiPSC المزروعة على المجالات المتعددة الأطراف. أثناء التسجيل ، حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ، ومنع التبخر المتوسط وتغيرات الأس الهيدروجيني من خلال توفير تدفق بطيء مستمر للغاز المرطب إلى المناطق المتوسطة.

بعد ذلك ، قم بتحليل البيانات باستخدام حزمة برامج مخصصة. يوضح هذا الشكل تغيرات التعبير عن العلامات العصبية MAP2 في المشبك أثناء عملية التمايز ، مما يشير إلى نضوج الخلايا العصبية. يوضح هذا الرسم البياني أن تعبير synapsin يتم قياسه للخلايا الفردية التي زادت أثناء عملية التمايز.

المشابك التي يتم التعبير عنها في الخلايا بعد ثلاثة أسابيع من التمايز موضعية مع PSD-95 ، مما يشير إلى وجود نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. هنا ، تم إجراء مشبك رقعة الخلية بالكامل في نقاط زمنية مختلفة أثناء عملية التمايز لقياس النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا. كانت الخلايا قادرة على توليد إمكانات الفعل في نقاط زمنية مختلفة.

وتظهر النسبة المئوية للخلايا المتصاعدة التي زادت بمرور الوقت أن غالبية الخلايا قادرة على توليد إمكانات عمل ، حتى في المرحلة المبكرة من التمايز. تم استخدام مشبك التصحيح أيضا لقياس التيارات المثيرة بعد المشبكي التي تتلقاها الخلايا. زاد عدد المدخلات التي تتلقاها الخلايا أثناء عملية التمايز.

زاد كل من تردد وسعة التيارات المثيرة بعد المشبكي أثناء عملية التمايز. تم قياس النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا المتمايزة على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة أثناء عملية التمايز. هنا ، زاد نشاط الشبكة العصبية أثناء عملية التمايز ، وأظهر أحداثا متزامنة بعد 23 يوما.

بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لتمييز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى شبكات عصبية وظيفية في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل المعقم ومعالجة الخلايا بلطف. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الاختبارات الدوائية لإنقاذ النمط الظاهري ، الذي لوحظ في خطوط خلايا المرضى.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لدراسة عيوب نشاط الشبكة رسميا في الاضطرابات العصبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التفريق ، وتحفيز الخلايا الجذعية متعددة القدرات في الخلايا العصبية بطريقة سريعة وخاضعة للرقابة.