تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في C. ايليجانس الخط الجرثومي

الهدف العام من هذه التجربة هو فحص مستويات ERK النشطة في الجسم الحي في الغدد التناسلية C.elegans. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات ERK والخلايا الجرثومية ، مثل تأثيرات العلاجات الدوائية أو الاضطرابات الجينية على مسار RAS-ERK وبالتالي تطور الخلايا الجرثومية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن قياس نمط إشارة ERK وقوتها في الجسم الحي.

اختر 100 إلى 150 دودة في مرحلة النمو المرغوبة واجمعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9. بعد ذلك ، املأ أنبوب الطرد المركزي الدقيق ب 900 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت M9 وقم بتشغيله بجهاز طرد مركزي عند 1000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 برفق.

ثم كرر الغسيل مرتين أخريين لإزالة معظم البكتيريا الملتصقة. بعد ذلك ، باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر مع تجويف عريض ، انقل الديدان في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 إلى طبق ساعة زجاجي مسطح القاع. ثم أضف واحدا إلى ثلاثة ميكرولتر من 0.1 مولار ليفاميزول إلى الطبق وقم بتدويره برفق.

الآن ، قم بتوصيل إبرتين بقياس 25 بحقنتين لعمل أداة تشريح واحدة لكل يد. تحت مجهر تشريح ، ضع كل إبرة أسفل كل دودة وفوقها وقم بعمل قطع دقيق على كل دودة بالقرب من البصلة البلعومية الثانية ، باستخدام حركة تشبه المقص. قم بقص جميع مرة واحدة على الأقل ، كل ذلك في غضون خمس دقائق ، حتى يظل Levamisole فعالا.

المهم جدا أن يكتمل تشريح في الطبق في أقل من خمس دقائق. في حالة عدم ظهور الغدد التناسلية المبثوقة ، ما عليك سوى تخطي هذا. تظهر هنا الغدد التناسلية المبثوقة المناسبة.

بعد اكتمال التشريح ، أضف ملليلترين من 3٪ بارافورمالدهايد مباشرة إلى طبق الساعة الزجاجي وقم بتغطيته ببارافيلم تحت غطاء الدخان ثم انتظر عشر دقائق. بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور زجاجية تسعة بوصات ، أضف ثلاثة ملليلتر من PBS-T إلى زجاج الساعة واخلط المحلول باستخدام الماصة.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة زجاجية جديدة ، اسحب خمسة ملليلتر من السائل الذي يحتوي على الديدان وانقلها إلى أنبوب مخروطي زجاجي جديد سعة خمسة ملليلتر. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي سريري عند 1000 جم. الآن ، تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها دون إزعاج الأنسجة التشريح.

بعد ذلك ، باستخدام خمسة مليلتر من PBS-T ، كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين وانتهي بالديدان في حجم صغير من المحلول. بعد ذلك، باستخدام ماصة زجاجية، أضف ملليلترين من الميثانول بنسبة 100٪ واخلط المناديل برفق عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة باستور جديدة. الآن ، احتضن الأنبوب عند سالب 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بعد معالجة الميثانول ، قم بإجراء ثلاث غسلات PBS-T وانتهي بحوالي 500 ميكرولتر من PBS-T. الآن ، باستخدام ماصة باستور جديدة ، انقل الأنسجة إلى أنبوب زجاجي جديد سعة مليلتر واحد واتركها تستقر عن طريق الجاذبية. بعد خمس إلى 10 دقائق ، استخدم ماصة جديدة وبمساعدة المجهر لإزالة أكبر قدر ممكن من الغسيل من الأنبوب دون إزعاج الأنسجة.

لبدء الكتلة ، أضف 100 ميكرولتر من مصل الماعز العادي بنسبة 30٪ ، وهو المخزن المؤقت للحظر. ثم قم بتغطية الأنبوب ب Parafilm واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ساعة ، باستخدام المجهر ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل باستخدام ماصة جديدة.

بعد ذلك ، اصنع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد MAPKYT المخفف عند واحد من كل 400 في 30٪ NGS وأضفه إلى الأنسجة. ثم أغلق الأنبوب باستخدام بارافيلم واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتسخين الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة وأضف 800 ميكرولتر من PBS-T.

بعد ذلك، اسحب العينة إلى ماصة زجاجية جديدة وحررها برفق لعمل تعليق متساو. بمجرد أن تستقر الأنسجة في القاع ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وكرر الغسيل ثلاث مرات ، باستخدام ماصة جديدة دائما ولا تستخدم دوامة أبدا. يتم تطبيق الجسم المضاد الثانوي تماما مثل الجسم المضاد الأولي ، ويتم إيلاء الاعتبار الإضافي فقط لإبقاء الأنسجة في الظلام من الآن فصاعدا حتى يمكن تصويرها.

بعد الحضانة بالجسم المضاد الثانوي ، أضف 800 ميكرولتر من محلول DAPI المخفف إلى الأنسجة بمجرد إزالة الغسيل الأخير. قم بتغطية فم الأنبوب ب Parafilm واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. في وقت لاحق، تحت مجهر التشريح، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول DAPI باستخدام ماصة جديدة.

بعد إزالة البقعة الأخيرة أو الغسيل ، أضف قطرة واحدة من محلول التثبيت إلى الأنابيب. الآن ، قم بإعداد شريحة متصاعدة مع وسادة agarose. أضف قطرة من 2٪ agarose المذاب إلى شريحة زجاجية نظيفة وضع بسرعة شريحة نظيفة ثانية عمودية على الاغاروز وفوقها.

أخيرا ، قم بإزالة شريحة المجهر العلوي برفق شديد. الآن ، انقل التي تم تشريحها إلى الوسادة وقم بإزالة كل السائل الزائد من الوسادة بمساعدة المجهر. أخيرا ، قم بتطبيق زلة غطاء مقاس 24 × 50 ملم دون تكوين فقاعات هواء.

بمجرد تطبيق زلة الغطاء ، لا تقم بتطبيق أي ضغط إضافي. غالبا ما يؤدي هذا إلى فقدان الإشارة. كشفت الصور التمثيلية للحيوانات الخنثى البالغة من النوع البري أن الشكل النشط ثنائي الفوسفورة من ERK يتم تصويره عادة في منطقة منتصف Pachytene ، والمنطقة 1 ، وفي البويضات الأكثر نضجا في المنطقة 2.

تعكس الاضطرابات في نمط التنشيط هذا التغييرات في مسار الإشارات. لا تحدد السلالات الجرثومية الأنثوية المنوية وبالتالي لا تعرض تنشيط ERK في المنطقة 2 ، مع تنشيط ضعيف فقط في المنطقة 1. بمجرد إتقانها ، يمكن أن تستغرق هذه التقنية ، على الأكثر ، يومين ، حيث يستغرق اليوم الأول أكبر قدر من الوقت ، مع ساعة واحدة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل أسماك الحمض النووي الريبي لتحديد الأشياء ، مثل مستوى نسخة الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى معلومات وفرة البروتين. بعد تطويرها في عام 1995 ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تطوير الخلايا الجرثومية لفحص مستويات وفرة البروتين في الجسم الحي واتباع مورفولوجيا الكروموسوم في C.elegans.