Name: تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في C. ايليجانس الخط الجرثومي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: اكتشف تقنية التصوير المناعي لتحديد موقع إرك النشط في غدد C. elegans. تتيح هذه الطريقة قياس أنماط الإشارة وقوتها في الجسم الحي، مما يساعد على دراسة تطور الخلايا الجرثومية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

العمل في مختبر Arur مدعوم بمنح من المعاهد الوطنية للصحة ، NIHGM98200; معهد أبحاث الوقاية من السرطان في تكساس ، CPRIT RP160023 ؛ جائزة الباحث العلمي لجمعية السرطان الأمريكية (ACS RSG014-044-DDC) ؛ وصناديق آنا فولر.

<ol><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410, 37-40 (2001).</li>
<li>McKay, M. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+signals+from+RTKs+to+ERK%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK.</a> Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).</li>
<li>Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSundaram%2C+MV+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-38 (2013).</li>
<li>Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+apoptosis%3A+a+dysregulated+balance+in+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer.</a> Liver Int. 27, 155-162 (2007).</li>
<li>Hackett, A., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR1+Pfeiffer+syndrome+without+craniosynostosis%3A+an+additional+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report.</a> Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).</li>
<li>Murphy, L. O., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+specificity%3A+the+right+place+at+the+right+time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">MAPK signal specificity: the right place at the right time.</a> Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).</li>
<li>Vogels, A., Fryns, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pfeiffer+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Pfeiffer syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 1, 19(2006).</li>
<li>Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+induces+survival+and+differentiation+through+two+distinct+signaling+cascades+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells.</a> Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).</li>
<li>Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+transient+versus+sustained+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation.</a> Cell. 80, 179-185 (1995).</li>
<li>Chang, C., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+vulval+development+as+a+model+system+to+study+the+cancer+biology+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling.</a> Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).</li>
<li>Lee, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+functions+and+dynamic+activation+of+MPK-1+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development.</a> Genetics. 177, 2039-2062 (2007).</li>
<li>Lopez, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-2+and+ERK+couple+nutrient+availability+to+meiotic+progression+during+Caenorhabditis+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis.</a> Dev Cell. 27, 227-240 (2013).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291, 2144-2147 (2001).</li>
<li>Ohmachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+ksr-1+and+ksr-2+have+both+unique+and+redundant+functions+and+are+required+for+MPK-1+ERK+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation.</a> Curr Biol. 12, 427-433 (2002).</li>
<li>Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+genes+of+the+MAP+kinase+cascade%2C+mek-2%2C+mpk-1%2Fsur-1+and+let-60+ras%2C+are+required+for+meiotic+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 121, 2525-2535 (1995).</li>
<li>Hubbard, E. J., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+a+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).</li>
<li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPK-1+ERK+controls+membrane+organization+in+C.+elegans+oogenesis+via+a+sex-determination+module%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module.</a> Dev Cell. 20, 677-688 (2011).</li>
<li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ERK+substrates+execute+single+biological+processes+in+Caenorhabditis+elegans+germ-line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).</li>
<li>Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transport+Model+for+Estimating+the+Time+Course+of+ERK+Activation+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline.</a> Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141, 1399-1406 (1995).</li>
<li>Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gld-1%2C+a+tumor+suppressor+gene+required+for+oocyte+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139, 579-606 (1995).</li>
<li>Seydoux, G., Dunn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally+repressed+germ+cells+lack+a+subpopulation+of+phosphorylated+RNA+polymerase+II+in+early+embryos+of+Caenorhabditis+elegans+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster.</a> Development. 124, 2191-2201 (1997).</li>
</ol>

وأعلن أصحاب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

إرك النشط (dpERK) يتبع المكاني وديناميكية نمط التعريب النمطية في C. ايليجانس سلالة الجرثومية. هذه النمطية dpERK النمط المكاني (الشكل 5)، والسعة في مرحلة البلوغ C. ايليجانس الغدد التناسلية، ويمكن أن تكون مرتبطة بشكل فعال مع العديد من العمليات البيولوجية التي تنظم إرك. على سبيل المثال، عدم القدرة على تفعيل إرك في المنطقة 2 النتائج في الاعتقال في البويضات في الطور الأول من الانقسام الاختزالي، النمط الظاهري لوحظ في germlines الإناث التي لا تحدد الحيوانات المنوية، وبالتالي لم تقم بتنشيط إرك في البويضات الناضجة (الشكل 5). التزاوج مع نتائج الذكور في تراكم الفعال للdpERK في المنطقة 2 في germlines الإناث 11،13، إلى جانب ظهور نضوج البويضة والإباضة. وهكذا تحليل الأنماط المكانية والزمانية تفعيل من dpERK على بعض الاضطرابات الوراثية (مثل تدخل الجيش الملكي النيبالي تثبيط الجين بوساطة) أو العلاجات الكيميائية يسمح لتحديد العوامل التي reguأواخر إشارات إرك والعمليات البيولوجية وبالتالي إرك التي تعتمد على. هذه التحليلات أيضا تمكين اكتشاف التفاعلات وراثية جديدة بين مسارات إشارات. وعنق الزجاجة للأي تحليل التصوير القائم هو توافر الكواشف وظيفية مثل الأجسام المضادة التي تخص التطبيق. في حالة وجود مثل هذا كاشف ثم طرق مثل تلك المذكورة أعلاه يمكن أن تتكيف بسهولة لتحليل نمط التعريب لأي بروتين من الفائدة. وبالتالي يحد من الطلب من قبل توافر الأجسام المضادة عمل. بالإضافة إلى ذلك، لأن أسلوب يصف تشريح وتلطيخ في وقت تنموي معين، لا يمكننا إلا التقاط المعلومات في إطار زمني واحد، ولا تسليط الضوء على ديناميات أو تنظيم البروتين في الوقت الحقيقي أو معدل دوران البروتين. ويتم تكييف الطريقة الموصوفة أعلاه من فرانسيس وآخرون. 23، والذي يختلف من سيدو ودان مethod 24 البثق الغدد التناسلية وتلوين الأجسام المضادة. وسوف يطلق على الأسلوب على أساس فرانسيس وآخرون. &quot;طريقة تعليق&quot; وطريقة سيدو ودان يسمى &quot;تجميد تكسير طريقة&quot; للمقارنة. وكانت طريقة تعليق فعالة جدا في أيدينا للحصول على أنماط توطين استنساخه من الجزيئات مما يشير مثل dpERK، التي هي بطبيعتها أكثر حساسية لظروف معالجة قاسية. في حالة dpERK التعريب، في تجربتنا، والإشارة في منطقة 1 غير قابل للكشف عمليا مع أسلوب تجميد تكسير. بالإضافة إلى ذلك، عينة التجفيف، والتي يمكن أن تحدث في كثير من الأحيان مع طريقة التجميد تكسير، والنتائج في إشارات الأجسام المضادة زائفة. طريقة تعليق يقلل عينة التجفيف، حيث يتم تعليق الغدد التناسلية في السائل طوال العملية. نجد أيضا أن الطريقة تعليق مفيد لتصوير متعددة الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة. على سبيل المثال، إذا كان اثنان المورثات، مثل المنحرفين مقابلالإناث إلى أن مباشرة مقارنة لdpERK التوطين، والمورثات اثنين يمكن أن تكون مختلطة معا ومعالجتها. وهذا ممكن لأن الظواهر تختلف ويمكن تمييزها عن طريق الأشكال التضاريسية دابي. تلطيخ في نفس أنبوب تليها التصوير على نفس الشريحة يسمح للمقارنة مباشرة بين الغدد التناسلية من المورثات مختلفة. بدلا من ذلك، إذا كانت الأشكال التضاريسية دابي ليست مميزة، ثم على بعد خطوتين تلوين الأجسام المضادة يمكن اعتمادها. لأول مرة يتم التعامل مع كل الوراثي الفردي مع اثنين من الأجسام المضادة متميزة، الجسم المضاد ألف لWT والجسم المضاد B لمتحولة (سواء الأجسام المضادة تحتاج إلى أن تثار في مجموعة متميزة من الأجسام المضادة dpERK). مرة واحدة وقد تم ملطخة المورثات مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية، وغسلها، وأنها يمكن أن تكون مختلطة معا في أنبوب واحد وملطخة الآن مع الأجسام المضادة dpERK، تليها علاج الأجسام المضادة الثانوية إلى تصور كل الأجسام المضادة في الأنبوب. القدرة على المقارنة بين الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة، وخصوصا عندما دوتبذل eductions من أنماط تنشيط يضمن تفسيرات دقيقة لا يتأثر الظروف تلطيخ متميزة. في حين مفيد، وهناك خطوات متعددة في جميع أنحاء طريقة تعليق تتطلب المعالجة المتأنية. ومن الأهمية بمكان أن تحدث تشريح في الوقت بكفاءة. الأهم من ذلك، ينبغي أن تشريح لا تأخذ أكثر من 5 دقائق. مرات تشريح الأطول تؤدي في إشارة dpERK المتغيرة، التي غالبا ما يساء فهمها على أنها تغييرات ينظم في تفعيل إرك، وليس الفشل كما الفنية. ومن الأهمية بمكان أن تبدأ مع أكثر من 100-150 الحيوانات لكل تشريح لجميع أنحاء غسل مختلف الخطوات التي يمكن بسهولة الغدد التناسلية تضيع من الأنابيب بسبب أخطاء pipetting ل. فقدان الغدد التناسلية يمكن تخفيض إما عن طريق تشريح في دفعات صغيرة متعددة (مثل ثلاث دفعات من 50 الحيوانات لكل منهما) التي يمكن دمجها، أو عن طريق تشريح دفعة واحدة كبيرة من 150. وهناك تحد آخر هو الحصول على الغدد التناسلية للكذب في-متباعدة بشكل جيد تشكيلعلى الشريحة بحيث الغدد التناسلية البعيدة بأكمله ولا يمكن تصوير. لتمكين هذا، استخدم رمش على عود ثقاب أو ماصة سحبت إلى الفضاء خارج الغدد التناسلية. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر حتى لا تتلف الغدد التناسلية أثناء هذه العملية. في كثير من الأحيان مع هذه التقنيات يستغرق عدة محاولات السيطرة على تشريح وكذلك الترتيبات من الغدد التناسلية على الشرائح. بمجرد يتقن هذه التقنية، وهي بمثابة وسيلة قوية للتحاليل البيولوجية المتنوعة، ويمكن استخدامها لدراسة أكثر من مستويات dpERK فقط. على سبيل المثال هذه الطريقة يمكن استخدامها لتصور مستويات النشطة P38، أو مستويات معلمين النشطة، أو أي البروتين الذي يوجد كاشف الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يقترن الأسلوب مع شاشة تثبيط الكيميائية في الحيوانات كلها لفحص لمثبطات جديدة أو تفعيل للمسار، عبر يعاير لمستويات dpERK. وهذا سوف يسمح لقراءات في الجسم الحي من كل من رد الفعل والحساسية تجاه أي من مثبطات التي قد كثافة العملياتeract مع إشارات الطريق RTK-RAS-إرك. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في تركيبات الأجسام المضادة مع مخرجات الإشارات المتعددة التي يمكن لجميع استخدامها، وتصور في وقت واحد. باستخدام الأجسام المضادة متعددة يسمح ارتباط بين مسارات متعددة، وحالة تفعيلها، ونتائج كل داخل الأنسجة نفسها، مما يتيح فهم أفضل لهذه التفاعلات. هذه ليست سوى أمثلة قليلة على مزيد من التطبيقات لهذه الطريقة، ولكن هذا النظام يمكن تعديلها لدراسة اهتمامات بحثية متعددة.

ومستقبلات التيروزين كيناز (RTK) -RAt اللحمي (RAS) -Extracellular إشارة ينظم كيناز (إرك) مسار التتابع إشارات خارج الخلية من خلال سلسلة كيناز الحفظ الذي ينتج في الفسفرة وتفعيل إرك 1-3. البروتينات إرك أعضاء في الموجه البرولين الحفظ سيرين / ثريونين MAP (Mitogen المنشط البروتين) عائلة كيناز، وتفعيلها مباشرة من قبل منظمة مجاهدي خلق عبر الفسفرة المزدوجة على ثريونين (T) والتيروزين (Y) من عزر TEY محفوظ. إرك نشط (المشار إليها باسم diphosphorylated إرك، أو dpERK) ثم ينظم العديد من العمليات الخلوية والتنموية من خلال الفسفرة للبطارية من ركائز المصب 1-3. وهكذا النشاط إرك غير طبيعي يؤدي إلى العديد من الخلايا والعيوب التنموية 4-7. تنظيم صارم من النشاط إرك هو أمر حاسم لتنمية العادية: في أنظمة الثدييات الكثير من النشاط إرك يؤدي إلى الإفراط الرائدة انتشار الخليويإلى نمو أنكجنيك. النشاط القليل جدا يؤدي إلى موت الخلايا 4،6. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات في مدة النشاط إرك يؤدي أيضا إلى نتائج مختلفة: في الخلايا PC12، وتفعيل إرك لمدة 30 دقيقة أو أقل الحث تكاثر الخلايا، ولكن تفعيل إرك لمدة 60 دقيقة أو أكثر الحث تمايز الخلايا العصبية 8،9. تنظيم محكم من النشاط إرك وبالتالي من الضروري بشكل واضح عن التطور الطبيعي والتوازن. C. ايليجانس هي قوية، ومرن وراثيا نظام نموذجي لتشريح وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير مسار 3،10-15. بالنسبة لأنظمة الثدييات، والتي تحتوي على جينات متعددة لRAS وإرك، C. يحتوي ايليجانس جين واحد RAS (السماح-60) والجينات إرك واحد (MPK - 1)، مما يجعله نظاما وراثيا أكثر سطحي التي لتشريح وظيفة هذا المسار 3،10-14. وC. ايليجانس الخط الجرثومي هو في الأساس الأنبوب الذي يتكون من الإنقساميةالخلايا الجذعية في نهايته البعيدة والبويضات الناضجة في نهاية القريبة لها (الشكل 1) 16. الخلايا الجرثومية الشروع الانقسام الاختزالي فقط القريبة إلى منطقة الإنقسامية البعيدة، والتقدم من خلال الطور التمهيدي الموسع الانتصافي (طور التثخن)، وبعد ذلك البدء في تشكيل البويضات في المنطقة حلقة، تمر أخيرا بويضة النضوج في المنطقة القريبة 16. وقد أظهرت الدراسات الجينية من مختبرات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، أن مسار RTK-RAS-إرك أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية في C. ايليجانس 12،13،15،17-19. على وجه التحديد، وجدنا أن الضوابط إرك وينسق لا يقل عن تسعة العمليات البيولوجية متميزة خلال تطوير سلالة الجرثومية، بدءا من مفاتيح التنموية مثل جرثومة خلية موت الخلايا المبرمج للخلية العمليات البيولوجية مثل 11،18 نمو البويضة. يشبه إلى حد كبير في أنظمة الثدييات، والكثير من النشاط إرك في C. ايليجانس النتائج سلالة الجرثومية في إنتاج البويضات صغيرة متعددة، في حين لى أيضانتائج النشاط ttle في واحدة بويضة كبيرة (11). وبالتالي تنظيم محكم من dpERK أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية الطبيعية. النموذج النشط من إرك، كما تصور من قبل الأجسام المضادة المحددة لdpERK، يعرض النمطية، ودينامية، النسقين نمط التعريب: dpERK مرتفعة خلال منتصف طور التثخن (المنطقة 1، الشكل 1)، وانخفاض في المنطقة حلقة وارتفاع مرة أخرى في ناضجة البويضات (المنطقة 2، الشكل 1). مؤخرا، وجدنا أن التغذية تعمل من خلال عامل النمو الذي يشبه الانسولين مستقبلات 1 (داف-2) لتنشيط إرك في المنطقة 1 12؛ وأظهر العمل قبل أن إشارة الحيوانات المنوية (عبر Ephrin مستقبلات التيروزين كيناز) ينشط إرك في المنطقة 2 13. وبالنظر إلى أن وظائف إرك النشطة بمثابة مقاومة متغيرة في سلالة الجرثومية لتنظيم نمو البويضة، توطين المكاني والزماني، فضلا عن اتساع dpERK، هو المفتاح لفهم نتائج الإشارات العادية. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، والتغيرات فيتوطين النمطي للdpERK يمكن رصدها بسهولة والتنبؤات المستمدة من تأثير الاضطرابات البيئية أو الوراثية على النشاط إرك وبالتالي وظيفة. وهكذا، يعاير لdpERK يتيح فهم شامل لدورها خلال تطوير سلالة الجرثومية.

<table><tbody><tr><td>شركة Agarose</td><td>Sigma Inc.</td><td>A9539</td><td>قم بإذابة 2 جم في 100 مل لعمل محلول 2٪</td></tr><tr><td>طبق ساعة زجاجي مسطح</td> القاع <td>Agar Scientific</td><td>AGL4161</td><td>نستخدم الزجاج لأن الغدد التناسلية المقطعة غالبا ما تلتصق بإبر بلاستيكية</td></tr><tr><td>25 جم</td> BD <td>PrecisionGlide</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>المحاقن (يمكن أن تكون 1 أو 5 مل) محاقن</td> <td>BD</td><td>1 مل: شرائح مجهر 309659</td><td></td></tr><tr><td>BD (25 × 75 × 1.0 مم)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>أغطية (24 × 50 مم)</td><td>كورنينج</td><td>2935-245</td><td></td></tr><tr><td>5 مل أنبوب زجاجي مخروطي</td><td>الشكل Corning</td><td>8060-5</td><td></td></tr><tr><td>9 "ماصة باستور يمكن التخلص منها</td><td>فيشربراند</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>أجهزة طرد</td><td></td><td></td><td></td>مركزي سريرية أعلى</tr> مقاعد <tr><td>البدلاء زجاج &nbsp; أنابيب (6 × 50 مم)</td><td>حل Fisherbrand</td><td>14-958-A</td><td></td></tr> <tr><td>* M9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>3٪ بارافورمالدهيد (PFA)</td><td>خدمات المجهر الإلكتروني</td><td>17500</td><td>تم الحصول عليها كمحلول 16٪ في أمبولات ، ومخففة إلى 3٪ في عازلة فوسفات البوتاسيوم</td></tr><tr><td>1x PBS-T</td><td>1x PBS مع 0.1٪ Tween 20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>خدمات الفحص المجهري الإلكتروني</td><td>للميثانول</td><td>18510</td><td></td></tr><tr><td>الماعز العادي مصل (NGS)</td> <td>إشارات الخلية</td><td>5425</td><td>مخفف إلى 30٪ في 1x PBS-T</td></tr><tr><td>MAPKYT (dpERK) الجسم المضاد &nbsp;</td><td>شركة سيجما</td><td>M9692</td><td>التخفيف 1: 400 في 30٪ NGS</td></tr><tr><td>الجسم المضاد الثانوي</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>التخفيف 1: 500 في 30٪ NGS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr> <tr><td>* M9 وصفة</td><td></td><td></td> عازلة <td>3 جم KH2PO4 ، 6 جم Na2HPO4 ، 5 جم كلوريد الصوديوم ، 1 مل 1 م MgSO4 ، H2O إلى 1 L. & nbsp ؛</td></tr><tr><td>**PBS (1x)</td><td></td><td></td><td>8 جم كلوريد الصوديوم ، 0.2 جم كلوريد كلوريد الصوديوم ، 1.44 جم كلوريد الصوديوم < الفرعي > 2 < / فرعي >HPO4 ، 0.24 جم كيلو هيلوسنة < فرعية >2 < / فرعي > PO 4 ، 0.133 جم كلور المكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > ، 0.10 جم MgCl < > 2 < / فرعي > ، H2O إلى 1 لتر</td></tr><tr><td>وسط نمو الديدان الخيطية (NGM)</td><td></td><td></td> <td>3 جم كلوريد الصوديوم ، 17 جم أجار ، 2.5 جم بيبتون ، 975 مل من الماء في 2 لتر قارورة إرلينماير. الأوتوكلاف لمدة 50 دقيقة. تبرد ، وأضف 1 مل من 1 M CaCl 2 ، 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول ، 1 مل من 1 M MgSO4 و 25 مل من 1 M KPO4.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; c. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

إشارة الخلية الحفظ تطويريا transducing RTK-RAS-إرك المسار هو سلسلة مما يشير كيناز الهامة التي تسيطر على العديد من العمليات الخلوية والتنموية أساسا عن طريق تنشيط إرك، كيناز النهائية للمسار. تنظيم محكم من النشاط إرك ضروري للتطور الطبيعي والتوازن. النتائج إرك نشطة بشكل مفرط في انتشار الخلوي المفرط، في حين الدرقية إرك يسبب موت الخلايا. C. ايليجانس هو نظام نموذجي القوية التي ساعدت توصيف وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير المسار خلال التنمية. على وجه الخصوص، وطريقة RTK-RAS-إرك ضروري لC. ايليجانس تطوير سلالة الجرثومية، التي هي محور هذا الأسلوب. عن طريق الاجسام المضادة المحددة لشكل نشط، diphosphorylated من إرك (dpERK)، ونمط التعريب النمطية يمكن تصور داخل الخط الجرثومي. لأن هذا النمط هو مكانيا وزمانيا وسيطرواالطبعه، والقدرة على مقايسة بتكاثر dpERK مفيد لتحديد المنظمين من المسار الذي يؤثر على dpERK مدة إشارة والسعة والتنمية وبالتالي سلالة الجرثومية. نحن هنا لشرح كيفية تشريح بنجاح، وصمة عار، وdpERK الصورة داخل C. ايليجانس الغدد التناسلية. ويمكن تكييف هذه الطريقة لتوطين المكاني للأي إشارات أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، قدم الأجسام المضادة متوافق مع المناعي هو متاح.

في WT الكبار الحيوانات خنثوي، هو تصور dpERK عادة في منطقة منتصف طور التثخن، المنطقة 1، وفي البويضات الأكثر نضجا من -1 من خلال -4 أو -5 (المنطقة 2). الاضطرابات في هذا النمط تفعيل تعكس تغييرات على مسار الإشارات. germlines الإناث لا تحدد الحيوانات المنوية، وبالتالي لا تعرض تفعيل إرك في المنطقة 2، مع تفعيل ضعيف في المنطقة 1. وتتمثل هذه في الشكل (5). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" /> الشكل 1: C. ايليجانس سلالة الجرثومية الصرف. التفاضلية التداخل المقابل (DIC) صورة لخنثى الكبار مع الذراع الغدد التناسلية على شكل حرف U واحد المذكورة مع خط أبيض. والغدد التناسلية خنثوي الكبار يحتوي على خلايا الإنقسامية في الطرف البعيد. الخلايا الإنقسامية تدخل الانقسام الاختزالي والتقدم من خلال الطور الأول الانتصافي (طور التثخن) النامية في maturالبويضات الإلكترونية في الغدد التناسلية الداني. المنطقة 1 والمنطقة 2 علامة توطين النمطي للdpERK في الغدد التناسلية خنثوي الكبار. الحجم: 20 ميكرون <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" /> الشكل 2: مظاهرة من المراكز إبرة أثناء تشريح اليسار: صورة لتشريح في العملية. الصحيح: مواقف إبرة مع الإشارة إلى دودة <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" /> الشكل (3): مظاهرة من إعداد الاغاروز الشرائح. (أ) وضع lengthwis الشريطالبريد عبر 2 شرائح المجهر نظيفة. ضع شريحة المجهر نظيفة جديدة بين الشرائح اثنين مع الشريط كما هو مبين. الشرائح الثلاث بجانب بعضها البعض طوليا. (ب) إضافة ذاب الاغاروز إلى الشريحة في الوسط. (C) ضع شريحة المجهر جديدة عمودي، وعلى رأسها، الشريحة المتوسطة، تحمل قطرة الاغاروز. ( D) السماح للالاغاروز ليصلب. (E) إزالة الشريحة العليا تاركة وراءها وحة agarose طدت. استخدام الشريحة السفلية مع لوحة الاغاروز لgermlines تصاعد تشريح والملون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" /> الشكل 4: التصوير الشرائح كما المونتاج المونتاج من نوع سلالة الجرثومية البرية مع دابي (ر.المرجع) وقناة dpERK (القاع). الصور التي اتخذت في 63X مع تداخل الحدود، اتخذت المربعات البيضاء لوحة ألف وباء وصناديق خضراء لوحة باء وجيم ودابي وdpERK الصور لكل لوحة في وقت واحد في اثنين من قنوات مختلفة. يتم عرض صورة تجميعها في الشكل 5A. مقياس شريط: 20 ميكرومتر <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" /> الرقم 5: الديناميكي الزمنية / المكانية تفعيل إرك. (AC) WT (N2) الكبار (24 ساعة الماضية مرحلة منتصف L4 التنمية) germlines خنثى ملطخة الحمض النووي (B، دابي والأبيض) وdpERK (C، الحمراء). يتم تمييز إشارة dpERK في المنطقة 1 والمنطقة طور التثخن، والمنطقة 2، البويضات الناضجة. (DF)الضباب 2 (oz40) germlines الإناث (في 8 ساعة الماضية مرحلة منتصف L4 التنمية) ملطخة الحمض النووي (E، دابي) وdpERK (F). germlines الإناث الصغيرات عرض dpERK ضعيفة في المنطقة 1، وفي بويضة واحدة بطريقة مستقلة الحيوانات المنوية. المنطقة 2 هي الحيوانات المنوية يتوقف، وبالتالي غائبة في سلالة الجرثومية الإناث. مقياس شريط: 20 ميكرومتر <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

نقدم طريقة القائم على التصوير المناعي للتوطين المكاني والزماني لإرك نشط في C. تشريح ايليجانس الغدد التناسلية. بروتوكول صفها هنا يمكن تكييفها لرؤية أي إشارة أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، شريطة الضد كاشف مناسب هو متاح.

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

الهدف العام من هذه التجربة هو تقدير مستويات ERK النشطة داخل الجسم الحي (in vivo) في مناسل دودة C.elegans. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إشارات ERK والخلايا الجرثومية، مثل تأثيرات العلاجات الدوائية أو الاضطرابات الجينية على مسار RAS-ERK وبالتالي على تطور الخلايا الجرثومية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية قياس نمط وقوة إشارة ERK كمياً داخل الجسم الحي.اختر من 100 إلى 150 دودة في المرحلة النمائية المطلوبة واجمعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter يحتوي على 100 microliters من منظم M9. بعد ذلك، املأ أنبوب الطرد المركزي الدقيق بـ 900 microliters إضافية من منظم M9 وقم بطرده مركزياً عند 1000 times g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وباستخدام مجهر تشريحي، قم بإزالة 900 microliters من منظم M9 بلطف.ثم كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين لإزالة معظم البكتيريا الملتصقة. بعد ذلك، وباستخدام رأس ماصة ميكروبية سعة 200 ميكرولتر ذات فتحة واسعة، انقل الديدان في 100 ميكرولتر من منظم M9 إلى طبق ساعة زجاجي مسطح القاع. ثم أضف من واحد إلى ثلاثة ميكرولتر من Levamisole بتركيز 0.1 مولار إلى الطبق وقم بتدويره بلطف.الآن، ثبّت إبرتين بعيار 25 في حقنتين لصنع أداة تشريح واحدة لكل يد. وباستخدام مجهر تشريحي، ضع كل إبرة أسفل وفوق كل دودة وقم بإجراء قطع دقيق في كل دودة بالقرب من البصلة البلعومية الثانية، باستخدام حركة تشبه حركة المقص. اقطع جميع الحيوانات مرة واحدة على الأقل، على أن يتم ذلك في غضون خمس دقائق، لضمان بقاء الـ Levamisole فعالاً.من المهم جداً إتمام عملية تشريح الحيوانات الموجودة في الطبق في أقل من خمس دقائق. في حال عدم ظهور غدة تناسلية مقذوفة، يجب تجاوز ذلك الحيوان ببساطة. تظهر هنا الغدد التناسلية المقذوفة بشكل سليم.بعد اكتمال عملية التشريح، أضف تحت خزانة استرداد الأبخرة مليلترين من 3%paraformaldehyde مباشرة إلى طبق الساعة الزجاجي وغطِّه بـ Parafilm. ثم انتظر عشر دقائق. بعد ذلك، وباستخدام ماصة باستور زجاجية بطول تسع بوصات، أضف ثلاثة مليلترات من PBS-T إلى زجاجة الساعة وامزج المحلول باستخدام الماصة.بعد ذلك، وباستخدام ماصة زجاجية جديدة، اسحب خمسة ملليلترات من السائل الذي يحتوي على الديدان وانقلها إلى أنبوب مخروطي زجاجي جديد سعة خمسة ملليلترات. ثم قم بطرد مركزي للأنبوب لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي سريري عند 1000 g. الآن، وباستخدام مجهر تشريحي، قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه دون المساس بالأنسجة المشرحة.بعد ذلك، وباستخدام حصص قدرها 5 mL من PBS-T، كرر خطوة الغسل مرتين إضافيتين وانتهِ بترك الديدان في حجم صغير من المحلول. ثم، باستخدام ماصة زجاجية، أضف 2 mL من 100% Methanol وامزج الأنسجة برفق عن طريق سحبها للأعلى وللأسفل باستخدام ماصة Pasteur جديدة. الآن، قم بتحضين الأنبوب عند درجة حرارة -20 °C لمدة ساعة واحدة على الأقل.بعد المعالجة بالميثانول، قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام PBS-T وأنهِ العملية بحوالي 500 microliters من PBS-T. الآن، باستخدام ماصة باستور جديدة، انقل الأنسجة إلى أنبوب زجاجي جديد سعة one milliliter واتركها تترسب بفعل الجاذبية. بعد مرور خمس إلى 10 دقائق، استخدم ماصة جديدة وبمساعدة المجهر لإزالة أكبر قدر ممكن من سائل الغسيل من الأنبوب دون تحريك الأنسجة.لبدء عملية الحجب، أضف 100 µL من مصل الماعز الطبيعي بتركيز 30%، والذي يمثل محلول الحجب. بعد ذلك، غطِّ الأنبوب بـ Parafilm واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. وبعد مرور ساعة، وباستخدام المجهر، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل باستخدام ماصة جديدة.بعد ذلك، قم بتحضير 100 µL من أجسام MAPKYT المضادة المخففة بنسبة 1 إلى 400 في 30% NGS وأضفها إلى الأنسجة. ثم أحكم إغلاق الأنبوب باستخدام Parafilm واتركه للتحضين طوال الليل عند 4 °C. وفي اليوم التالي، ارفع درجة حرارة الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة وأضف 800 µL من PBS-T.بعد ذلك، اسحب العينة إلى ماصة زجاجية جديدة ثم أطلقها برفق لعمل معلق متجانس. وبمجرد استقرار الأنسجة في القاع، قم بإزالة الطافي بعناية وكرر عملية الغسل ثلاث مرات إجمالاً، مع استخدام ماصة جديدة في كل مرة وتجنب استخدام جهاز الخض (vortex) نهائياً. يُطبق الجسم المضاد الثانوي تماماً كالجسم المضاد الأولي، مع مراعاة الحفاظ على الأنسجة في الظلام من هذه المرحلة فصاعداً حتى يتم تصويرها.بعد الحضن مع الأجسام المضادة الثانوية، أضف 800 µL من محلول DAPI المخفف إلى الأنسجة بمجرد إزالة الغسلة الأخيرة. غطِّ فوهة الأنبوب باستخدام Parafilm واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. لاحقاً، وباستخدام مجهر تشريحي، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول DAPI باستخدام ماصة جديدة.بعد إزالة آخر صبغة أو غسول، أضف قطرة واحدة من محلول التثبيت إلى الأنابيب. والآن، قم بتجهيز شريحة تثبيت بها وسادة أغاروز. أضف قطرة من الأغاروز المذاب بنسبة 2% إلى شريحة زجاجية نظيفة، ثم ضع شريحة نظيفة ثانية بسرعة بشكل عمودي فوق الأغاروز.أخيرًا، قم بإزالة شريحة المجهر العلوية برفق شديد. الآن، انقل الحيوانات التي تم تشريحها إلى الوسادة وأزل جميع السوائل الزائدة من الوسادة بمساعدة المجهر. وأخيرًا، ضع غطاء شريحة بمقاس 24 by 50 millimeter دون تكوين فقاعات هوائية.بمجرد وضع غطاء الشريحة، لا تضغط عليه بشكل إضافي، حيث يؤدي ذلك غالباً إلى فقدان الإشارة. أظهرت صور تمثيلية لحيوانات خنثى بالغة من النوع البري أن الشكل النشط ثنائي الفسفرة لـ ERK يظهر عادةً في منطقة منتصف مرحلة الـ Pachytene، والمنطقة 1، وفي أكثر الخلايا البيضية نضجاً في المنطقة 2.تعكس الاضطرابات في نمط التنشيط هذا حدوث تغيرات في مسار تأشير الخلايا. لا تحدد السلالات الجرثومية الأنثوية الحيوانات المنوية، وبالتالي لا تظهر تنشيطاً لـ ERK في المنطقة 2، مع وجود تنشيط ضعيف فقط في المنطقة 1. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن أن تستغرق يومين كحد أقصى، حيث يتطلب اليوم الأول أكبر قدر من الوقت، بمعدل ساعة واحدة في حال تنفيذها بشكل صحيح.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل RNA fish لقياس كميات معينة، مثل مستوى نسخ RNA، بالإضافة إلى المعلومات المتعلقة بوفرة البروتين. ومنذ تطوير هذه التقنية في عام 1995، مهدت الطريق للباحثين في مجال تطور الخلايا الجرثومية لتقييم مستويات وفرة البروتين في الجسم الحي ومتابعة مورفولوجيا الكروموسومات في C.elegans.

spatial-and-temporal-analysis-of-active-erk-in-the-c-elegans-germline

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

وقد أجري تحليل لتحديد ميكروأري ملامح التعبير الجيني...

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

يصف هذا الفيديو طريقة لتشريح الغدد التناسلية من C. ايليجانس خنثى ، مما ينتج عنه أنسجة مناسبة للتلوين المناعي والتصوير الفلوري.

ج. ايليجانس بثق الغدد التناسلية: تقنية التشريح السريع

هنا يتم توضيح كيفية تتبع وقياس العمليات التنموية في C. ايليجانس. تعتمد الطرق المقدمة على أدوات مفتوحة المصدر يمكن تنفيذها بسهولة. يتم توضيح كيفية إعادة بناء نماذج شكل خلية ثلاثية الأبعاد ، وكيفية تتبع الهياكل الخلوية يدويا ، وكيفية تحليل التدفق المقلص القشري.

تتبع وقياس العمليات التنموية في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام أدوات المصدر المفتوح

تقود ساعة التجزئة التعبير الجيني التذبذبي عبر الأديم المتوسط قبل الصبغي (PSM). نشاط Dynamic Notch هو مفتاح هذه العملية. نستخدم التحليلات التصويرية والحسابية لاستخراج الديناميكيات الزمنية من بيانات التعبير المكاني لإثبات أن تعبير مستقبلات دلتا ويجند الشق يتأرجح في PSM للفقاريات.

الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

نحن نقدم طريقة مؤتمتة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد من germline ايليجانس كاينورهابديتيس . أسلوبنا يحدد عدد والموقف من كل نواة داخل الخط وتحليلات germline البروتين التوزيع وهيكل cytoskeletal.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

يتم وصف أسلوب التصوير القائم التي يمكن استخدامها لتحديد المرحلة S وتحليل ديناميات دورة الخلية في germline خنثي C. ايليجانس استخدام thymidine في إيدو التناظرية. هذا الأسلوب يتطلب لا المتسلسلات ومتوافق مع صبغة إيمونوفلوريسسينت.

تحليل دورة الخلية في Germline C. ايليجانس مع إيدو التناظرية Thymidine

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد وتركيب أجنة Caenorhabditis elegans ، وتسجيل التطور تحت مجهر 4D وتتبع سلالة الخلايا.

4D المجهري: كشف Caenorhabditis elegans التطور الجنيني باستخدام المجهر نومارسكي

يصف هذا البروتوكول تداخل الحمض النووي الريبي ومقايسة ChIP لدراسة الوراثة اللاجينية للإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي وتعديلات الكروماتين المرتبطة به في C. elegans.

تحليل الوراثة اللاجينية عبر الأجيال في C. elegans باستخدام مراسل الفلورسنت والترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

اعتلالات RASopathies هي متلازمات وراثية متعددة الأجهزة ناتجة عن فرط تنشيط مسار RAS-MAPK. تظهر المتغيرات المسببة للأمراض التي يحتمل أن تنتظر التحقق من الصحة باستمرار بينما تحد البينات قبل السريرية الضعيفة من العلاج. هنا ، نصف بروتوكولنا في الجسم الحي لاختبار مستويات تنشيط ERK المرتبطة ب RASopathy والتحقق من صحتها وتعديلها الدوائي أثناء التطور الجنيني عن طريق التصوير الحي FRET في أسماك الزرد الصحفية في سن المراهقة.

بروتوكول فعال لتقييم تعديل نشاط ERK في نماذج متلازمة نونان المبكرة لأسماك الزرد عبر الفحص المجهري الحي FRET والتألق المناعي

سير عمل حقن ميكروي بنظام CRISPR/Cas9 لوضع وسم فلوري داخلي في خط جرثوتي Caenorhabditis elegans للحصول على خطوط التوصيل المتماثلة لتحليل مواقع البروتينات في الجسم الحي.

الوسم الفلوري الداخلي المعتمد على CRISPR/Cas9 لجينات محددة في التهاب الكاينورهابديتس المهاجر

اكتشف تقنية التصوير المناعي لتحديد موقع إرك النشط في غدد C. elegans. تتيح هذه الطريقة قياس أنماط الإشارة وقوتها في الجسم الحي، مما يساعد على دراسة تطور الخلايا الجرثومية.

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في

استكشف المزيد من الفيديوهات