بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد القوى على رابط الهيكل الخلوي للهيكل الخلوي ، أو مركب LINC ، من خلال الفحص المجهري FRET في الخلايا الحية عبر جهاز استشعار حيوي مصمم لبروتين LINC المركب ، nesprin-2G. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النقل الميكانيكي ، مثل القوى الموضوعة على البروتينات في نواة الخلايا الحية ، وكيف تتغير هذه القوى في ظل ظروف مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قدرتها على قياس مستويات صغيرة جدا من القوة على البروتينات والخلايا الحية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من أجل التقاط الصور. من الصعب تحسين قوة الليزر المجهري واكتساب لتلقي إشارة جيدة بين جميع المجموعات التجريبية. للبدء ، قم بزراعة خلايا انفجار الألياف NIH 3T3 إلى ما بين 70٪ و 90٪ في طبق ثقافة خلايا من ستة آبار في حاضنة زراعة الخلايا القياسية مع تنظيم درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون.

في غطاء مزرعة الخلايا ، قم بإزالة الوسط وشطف كل بئر بحوالي 1 ملليلتر من وسط خلية المصل المخفض. أضف 800 ميكرولتر من وسط خلايا المصل المختزلة إلى كل بئر ، وضع الغرفة المكونة من ستة آبار في الحاضنة. بعد ذلك، قم بوضع ماصة 700 ميكرولتر من وسط خلايا المصل المختزلة في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحمل علامة L مع 35 ميكرولتر من محلول ناقل الدهون لتشكيل مزيج شفط الدهون.

امزج التعليق عن طريق سحب العينات. بعد ذلك، قم بإدخال 100 ميكرولتر من وسط خلية المصل المختزلة في كل من ستة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر تحمل علامة واحد إلى ستة. ماصة الحمض النووي للبلازما لمستشعر التوتر نسبرين ، والتحكم في القوة الصفرية مقطوعة الرأس ، و mTFP1 ، والزهرة في أنابيب من واحد إلى ستة ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

لا تعيد استخدام أطراف الماصة عند سحب أنواع مختلفة من الحمض النووي. بعد ذلك، قم بإخراج 100 ميكرولتر من مزيج الدهون من الأنبوب L في كل أنبوب مسمى، واخلطه عن طريق سحب العينات المتكرر، باستخدام ماصة نظيفة لكل أنبوب. احتضان التعليق لمدة 10 إلى 20 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من كل أنبوب مسمى إلى بئر من الغرفة المعدة المكونة من ستة آبار تحتوي على خلايا. قم بتسمية الجزء العلوي من كل بئر مع إضافة الحمض النووي المقابل. ثم ضع الغرفة المكونة من ستة آبار في حاضنة لمدة أربع إلى ست ساعات.

بعد الحضانة ، قم بشفط الوسط ، وأضف ملليلترا إلى ملليلترين من وسط خلية المصل المختزلة للشطف. استنشق وسط خلية المصل المخفضة ، وأضف ملليلترين من التربسين إلى كل بئر قبل وضع الطبق المكون من ستة آبار في الحاضنة لمدة خمس إلى 15 دقيقة. أثناء انفصال الخلايا في الحاضنة ، قم بتغطية ستة أطباق عرض ذات قاع زجاجي بطبقة من الفيبرونيكتين بتركيز 20 ميكروغرام لكل مليلتر مذاب في محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

اسمح للأطباق بتغطية السطح في غطاء مزرعة الخلايا. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة ملليلترين من DMEM بمجرد فصل الخلايا. بعد ذلك ، انقل محتويات كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وقم بالدوران عند 90 مرة جم لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي دوار متأرجح.

قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات خلية في 1,000 ميكرولتر من DMEM باستخدام ماصة. استنشق خليط الفيبرونيكتين من الأطباق الزجاجية والماصة 1,000 ميكرولتر من كل معلق خلية على الأطباق. بعد أن تستقر الخلايا في قاع الأطباق الزجاجية ، أضف ملليلترا آخر من الوسائط إلى كل بئر.

اسمح للخلايا بتوصيل المستشعر والتعبير عنه في حاضنة الخلية لمدة 18 إلى 24 ساعة على الأقل. للتحقق من كفاءة التعدي ، استخدم مجهر فلوري مزود بتردد إثارة قريب من 462 نانومتر ل mTFP1 ، أو 525 نانومتر لكوكب الزهرة. استخدم مرشح انبعاث متمركز بالقرب من 492 نانومتر ل mTFP1 ، أو 525 نانومتر لزهرة الزهرة.

بعد حوالي 18 إلى 24 ساعة من الانتهاء من التعدي ، استخدم مجهر فلوري مقلوب لفحص كفاءة التعدي من خلال مقارنة عدد الخلايا الفلورية بالعدد الإجمالي للخلايا المعروضة. إذا تعذر تصوير الخلايا الحية في غضون 48 ساعة بعد التعداء ، فقم بإصلاح الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة خمس دقائق. اسمح للخلايا بالتعبير عن المستشعر لمدة 24 إلى 48 ساعة قبل التثبيت.

قم بتخزين الخلايا في PBS وعرضها بعد 48 ساعة. في غطاء مزرعة الخلية ، استبدل وسط الخلية بوسط تصوير مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪. ضع أطباق العرض في مرحلة المجهر متحد البؤر الذي يتم التحكم فيه في درجة الحرارة.

ضع طبق العرض الزجاجي مع الخلايا المنقولة mTFP1 فوق هدف الزيت بتكبير 60X بفتحة عددية تبلغ 1.4. حدد موقع الخلايا الشفبرة عن mTFP1 في وضع الفلورسنت واسع المجال. مع وجود خلية فلورية في مجال الرؤية ، حدد وضع الكشف الطيفي والتقط الصورة الطيفية.

قم بتضمين جميع الترددات التي تتجاوز 458 نانومتر بزيادات قدرها 10 نانومتر. حدد منطقة فلورسنت ساطعة على الخلية. أضف متوسط عائد الاستثمار الفلوري ككثافة طبيعية إلى قاعدة البيانات الطيفية بالنقر فوق حفظ الأطياف في قاعدة البيانات.

قم بتحسين طاقة الليزر واكتساب بحيث يتم تحقيق نسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء. ستختلف الإعدادات باختلاف المعدات. كرر العملية للخلايا التي تعبر عن كوكب الزهرة وابق في الوضع الطيفي.

استخدم تردد إثارة يبلغ 488 نانومتر بدلا من 458 نانومتر. اضبط إعدادات الطاقة حسب الحاجة ، ولكن لا تغير ترددات الانبعاث. حدد عائد استثمار فلورسنت ساطع يبلغ نصف قطر 20 بكسل تقريبا.

أضف متوسط عائد الاستثمار الفلوري باعتباره الكثافة الطبيعية إلى قاعدة البيانات الطيفية، بالنقر فوق حفظ الأطياف في قاعدة البيانات. لالتقاط الصور غير المختلطة ، قم أولا بتبديل وضع الالتقاط إلى فك المزج الطيفي. أضف البصمات الطيفية لكوكب الزهرة و mTFP1 إلى قنوات فك الخلط.

اضبط ليزر الإثارة مرة أخرى على مصدر أرجون 458 نانومتر. ضع طبق عرض مستشعر التوتر النسبرين فوق هدف الزيت 60X. بعد التركيز على خلية فلورسنت ذات تعبير ساطع بدرجة كافية ، اضبط الكسب وطاقة الليزر لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.

التقط ما لا يقل عن 15 إلى 20 صورة لخلايا مستشعر التوتر من نسبرين ذات السطوع المتشابه نسبيا وتجنب التشبع المفرط للبكسل. كرر عملية التقاط الصور باستخدام خلايا نسبرين مقطوعة الرأس باستخدام معلمات تصوير متطابقة. تظهر هنا صورة مكبرة تمثيلية بمقدار 10X للأرومات الليفية 3T3 المنقولة باستخدام مستشعر شد النسبرين باستخدام ناقل بوساطة الدهون.

عادة ، يتم نقل جزء صغير فقط من الخلايا في مجال رؤية معين. يظهر هنا زوج تمثيلي من نواتين 3T3 تعبر عن nesprin-TS في قنوات الزهرة و mTFP غير المختلطة طيفيا. تظهر صورة ملونة مدمجة للقناتين في أقصى اليمين.

فيما يلي عينة تمثيلية من النوى المقنعة nesprin-TS من خلايا MDCK المستقرة التي تعبر عنها على ركائز منقوشة وغير منقوشة. يتم تعريف صور النسبة على أنها نسبة قناة الزهرة مقسومة على قناة mTFP ويمكن استخدامها لإجراء مقارنات نسبية للقوة الكمية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسمية أنابيب الحمض النووي بعناية أثناء التعدي ، والحفاظ على معلمات التصوير ثابتة أثناء التقاط صور النتائج الطيفية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل الخلايا باستخدام مستشعر التوتر nesprin والتقاط الصور التي تم حلها طيفيا إلى مؤشر FRET للكمبيوتر الذي يرتبط بالقوة على مستشعر التوتر. على الرغم من أنه في هذه الحالة ، يتم استخدام مستشعر FRET للنسبرين ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقه على البروتينات الأخرى في الخلية حيث تكون قوة القياس مطلوبة.