ACT-المعزوفة: المقاصة الأنسجة البيولوجية وطرق Immunolabeling للتصوير حجم

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على الأنسجة السليمة والمتنظيفة وتصور معلوماتها الجزيئية ثلاثية الأبعاد باستخدام طرق الوسم المناعي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأعصاب وعلم الأحياء التنموي مثل الروابط العصبية والتصنيف الجزيئي والتغيير الهيكلي أثناء التطور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الأنسجة تمكن بوضوح من تحليل المستوى الخلوي الفرعي للعينات الكبيرة دون تقسيم.

لبدء هذا الإجراء ، قم باحتضان الأعضاء الثابتة في محلول مونومر هيدروجيل A4P0 عند أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة مع رج لطيف. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من محلول مونومر الهيدروجيل إلى أنبوب سفلي دائري سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك ، انقل عينة دماغ الفأر إليها ولف الجزء العلوي من الأنبوب باستخدام Parafilm.

بعد ذلك ، قم بفقاعة النيتروجين من خلال السائل مع عينة الدماغ المملوءة بالهيدروجيل لمدة دقيقة واحدة. أغلق العينة التي تحتوي على أنبوب بسرعة وإحكام. انقل الأنبوب إلى حمام مائي لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، تحقق من لزوجة الهيدروجيل ثم اغسل العينة المبلمرة لفترة وجيزة باستخدام 0.1 × PBS لإزالة الهيدروجيل الزائد. في هذه الخطوة ، انقل العينة المبلمرة إلى حاوية مناديل. ووضع حاوية المناديل في غرفة ETC.

بعد ذلك ، املأ غرفة ETC بمخزن مؤقت ETC باستخدام مضخة تمعجية. اضبط شروط ETC وقم بتشغيلها. يتم مسح شرائح الدماغ بسمك واحد إلى ملليمترين في غضون ساعتين.

ويتم تنظيف الدماغ بالكامل بشكل كاف في غضون خمس إلى ست ساعات. بعد ذلك ، انقل العينة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع 45 مل من 0.1 × PBS. اغسل العينة عدة مرات باستخدام 0.1 × PBS حتى لا تظهر فقاعات عند اهتزاز الأنبوب لفترة وجيزة لتأكيد الإزالة الكاملة ل SDS.

لإجراء c-PRESTO ، انقل عينة صغيرة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من محلول تخفيف الأجسام المضادة بعامل تخفيف من واحد إلى 500 للأجسام المضادة للكولاجين من النوع الرابع وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 600 مرة جم لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اغسل العينة الملطخة ب 0.1 × PBS عن طريق الطرد المركزي عند 600 مرة جم لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول تخفيف الأجسام المضادة بعامل تخفيف من واحد إلى 500 للجسم المضاد الثانوي المترافق Cy3 المضاد للأرانب وجهاز الطرد المركزي 600 مرة جم لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اغسل العينة الملطخة ب 0.1 × PBS عن طريق الطرد المركزي عند 600 مرة جم لمدة 30 دقيقة. لإجراء s-PRESTO للأنسجة الأكبر حجما ، انقل العينة إلى حقنة متصلة بصمام ثلاثي الاتجاهات في موضع الصمام المغلق.

أضف خمسة إلى سبعة ملليلتر من محلول تخفيف الأجسام المضادة بعامل تخفيف من واحد إلى 500 للأجسام المضادة للكولاجين من النوع الرابع. بعد ذلك ، أضف محلول الجسم المضاد إلى العينة عن طريق فتح الصمام. بعد ذلك ، في وضع الصمام المفتوح ، اضبط مكبس المحقنة على وضع 17 مليلتر لتوفير مساحة كافية لحركة سحب التسريب.

ثم أغلق الصمام ثلاثي الاتجاهات بعد الانتهاء من إعداد المحقنة. ضع المحقنة التي تحتوي على العينة على مضخة حقنة. اضبط ظروف مضخة الحقنة على حجم سحب التسريب يبلغ عشرة ملليلتر في الدقيقة ووقت إيقاف مؤقت لمدة أربع دقائق في وضع الدورة المستمرة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل مضخة الحقنة لمدة ثلاث إلى 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، افتح الصمام ثلاثي الاتجاهات واستبدل المحلول ب 0.1 × PBS. اغسل العينة الملطخة مرتين باستخدام 0.1 × PBS لمدة ساعة واحدة في كل مرة باستخدام مضخة المحقنة.

بعد ذلك ، استبدل PBS بمحلول تخفيف الأجسام المضادة الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي المترافق Cy3 المضاد للأرانب وقم بتشغيل مضخة الحقنة لمدة ثلاث إلى 24 ساعة. بعد ذلك ، افتح الصمام ثلاثي الاتجاهات واستبدل المحلول ب 0.1 × PBS. قبل التصوير ، احتضان العينة الملطخة بكمية مناسبة من محلول التركيب المكعب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف.

بعد ساعة ، استبدل المحلول بمحلول مكعب جديد واحتضنه لمدة ساعة إضافية. نظرا لأن الأجسام المضادة لا يمكنها اختراق الأنسجة الكثيفة عن طريق الانتشار ، فقد تم تصميم طرق الملصقات المناعية PRESTO لغرس الجزيئات الكبيرة بنشاط وتوصيل الكواشف إلى الأنسجة الكثيفة. سهل تطبيق قوى الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي قياسي على سطح الطاولة بشكل ملحوظ توصيل الأجسام المضادة.

كما أدى تطبيق التدفق الحراري باستخدام مضخة حقنة إلى تحسين اختراق الأجسام المضادة. بالنسبة ل s-PRESTO ، تم استخدام مضخة حقنة لتوصيل الأجسام المضادة. تم تصنيف أعضاء الفأر ، مثل الكلى والكبد ، بنوع الكولاجين 4.

بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، فإن ثلاث ساعات من c أو s-PRESTO تعزز بشكل ملحوظ عمق الملصقات. في الكلى والكبد ، يصل عمق المحور z إلى 300 إلى 350 ميكرومتر أو أعمق في عينات PRESTO ، بينما يتم تمييز عينات التحكم على عمق 40 إلى 50 ميكرومتر فقط. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنيات في يوم واحد للأنسجة بوضوح إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على وقت تثبيت الأنسجة مستحلب مونومر الهيدروجيل والأنسجة الكهربية بوضوح. بعد الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل وضع العلامات المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحليل الديناميكيات الخلوية وتحديد تجويف الخلايا العصبية عبر أعضاء متعددة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم الطبية لاستكشاف تشخيص الأمراض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية القيام بتضمين الهيدروجيل وبلمرة الأنسجة. لا تنس أن العمل باستخدام محلول مونومر الهيدروجيل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.