2D و 3D مصفوفات لدراسة إنفادوسوم الخطي تشكيل والنشاط

تعمل مجموعتنا على التفاعل بين الخلية والمصفوفة خارج الخلية. يمكن للخلايا أن تنتج ولكن يمكن أن تؤدي أيضا إلى تدهور عنصر المصفوفة خارج الخلية. يمكن أن يحدث تدهور المصفوفة أثناء العمليات الفسيولوجية ولكن أيضا في العمليات المرضية ، مثل التهاب الخلايا العصبية وغزو ورم الخلية.

على المستوى الخلوي ، يمكننا أن نلاحظ وجود بنية قائمة على الأكتين تشارك في تدهور المصفوفة. وتسمى هذه الهياكل الغازية. Invadosome ، إنه مصطلح عام بما في ذلك البودوسومات في الخلايا الطبيعية و invadopodia في الخلايا السرطانية.

يمكن أن يكون تدهور هذا الغازي منظما ذاتيا بأشكال ونقاط ومجاميع وريدات مختلفة. ونشاط هذا الغازي مدفوع بالبروتينات المعدنية ، مثل MMP2 و MT1-MMP. هذا ليس لفترة طويلة حيث يتم تنشيط الزوجين ، MMP2 ، MT1-MMP بواسطة ألياف الكولاجين من النوع 1.

لدراسة نشاط الغازيات ، تم استخدام مقايسة الزيموغرافيا الكلاسيكية في الموقع. ولكن لدراسة دور وتأثير ألياف الكولاجين من النوع 1 في الجسيمات الغازية ، قررنا إنشاء اختبار جديد. للقيام بذلك ، أنشأنا مصفوفة مختلطة تتكون من الجيلاتين وألياف الكولاجين من النوع 1.

في هذا الفيلم في الجزء الأول ، ستوضح لك Eloide Henriet كيف ننشئ هذا النوع من المصفوفة. في الجزء الثاني ، سيوضح لك زكريا الزوخري كيف يمكننا قياس تأثير ألياف الكولاجين من النوع 1 في مورفولوجيا وتكوين وتنشيط الجسيمات الغازية. وفي الجزء الأخير ، ستوضح لك جولي دي مارينو كيف نتكيف مع اختبار غزو الكولاجين ثلاثي الأبعاد.

سأوضح لك كيفية تحضير مصفوفة مختلطة مكونة من الجيلاتين وألياف الكولاجين من النوع 1. سأفعل نوعين من المصفوفة المختلطة. واحد لإجراء فحص الزيموغرافيا في الموقع باستخدام الجيلاتين الفلوريسين والكولاجين غير الفلوريسين من النوع 1.

وآخر يسمح لنا بتصور ألياف الكولاجين مع الجيلاتين غير الفلوريسين وألياف الكولاجين المسماة. لتحضير مصفوفة الجيلاتين ، قم بتقطيع 20 ميكرولتر قطرة من الجيلاتين على قطعة من البارافيلم. قم بتغطية كل قطرة بغطاء زجاجي معقم.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة واحميها من الضوء. لتثبيت الجيلاتين ، قم بتناول 40 قطرة ميكرولتر من 0.5٪ جلوتارالديهايد في PBS. باستخدام ملقط ، انقل الأغطية المطلية بالجيلاتين إلى كل قطرة جلوتارالديهايد.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة واحميها من الضوء. خذ لوحة زراعة خلايا متعددة الآبار واملأ كل بئر ب 500 ميكرولتر من 1X PBS المعقمة. في نهاية فترة الحضانة ، ضع كل غطاء ، جانب الجيلاتين لأعلى في كل بئر.

اغسل الأغطية مرتين في 1X PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما. في هذه الخطوة ، يمكن استخدام أغطية للتجريب أو تخزينها لاستخدامها لاحقا. ماصة 0.4 ملغ لكل مل كولاجين واحد في أنبوب.

أضف صبغة الفلورسنت للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام لكل مل. امزج المحلول في الأنبوب واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. خفف إلى الحجم النهائي باستخدام 1x DPBS وأضف 500 ميكرولتر من المحلول فوق أغطية مغلفة بالجيلاتين في طبق متعدد الآبار.

احتضن لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية لبلمرة الكولاجين. بعد الحضانة إزالة الكولاجين الزائد. أضف الخلايا للحصول على حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية قبل التثبيت.

يمكن تعديل هذا النوع من المصفوفات بعناصر مصفوفة أخرى مثل الفيبرونكتين أو الفيترونكتين أو الكولاجين من النوع الرابع. من ناحيتي ، سأوضح لك كيفية إجراء التألق المناعي باستخدام Tks5 ، وهي علامة على الغزوات ، وكيفية تحديد الغزوات الخطية على أغطية الكولاجين من النوع 1. يمكننا تقديم النتائج حسب عدد الخلايا الموجودة في الغزوات الخطية ، ولكن يمكننا أيضا تقديم عدد الهياكل في كل خلية.

قم بإصلاح أغطية لمدة 10 دقائق في 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد في PBS. اغسل مرتين باستخدام 1x PBS وقم باختراق الخلايا باستخدام 0.2٪ Triton X-100 في 1x PBS لمدة 10 دقائق. Aliquot 50 قطرة ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية في 4٪ BSA في 1x PBS على قطعة من البارافيلم

ضع كل غطاء على قطرة. احتضن لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. اغسل الأغطية مرتين باستخدام 1x PBS واحتضن الغطاء في الأجسام المضادة الثانوية والكولويدين وصبغة Hoechst لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.

بعد الحضانة ، اغسل مرتين باستخدام 1x PBS ، متبوعا بالماء المقطر لإزالة الأملاح. قم بتركيب أغطية على شريحة زجاجية مع وسط تركيب بلمرة. دع الشريحة تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.

لتحليل الصورة الحصول على صورة من الأكتين و Tks5 بالتتابع باستخدام المجهر متحد البؤر. لتحديد حجم وعدد الغزوات الخطية لكل خلية ، استخدم برنامج ImageJ والماكرو المقدم. قم أولا بتشغيل الماكرو في ImageJ وافتح صورة actin.

بعد ذلك ، افتح صورة Tks5. قم بتعيين الحد وتطبيق الماكرو. ستظهر النتائج التي تم تحليلها في جدولين.

سيكون عدد الجسيمات الغازية الخطية لكل خلية ومعلومات أخرى مثل النسبة المئوية للمساحة التي تستخدمها الجسيمات الغازية الخطية في الخلية في جدول الملخص. سيكون حجم كل غازي خطي في جدول النتائج. بعد القياس الكمي للصور ، يمكننا تقديم النتائج من خلال إظهار عدد الهياكل لكل خلية.

لذلك من جانبي ، نقوم بتكييف طريقة لإثبات وجود الغزوات الخطية في 3D. أدركنا أن الجل يتكون فقط من ألياف الكولاجين ويستخدم هذا الاختبار لتقييم غزو الخلية في سياق الكولاجين واحد. تحضير محلول الكولاجين من النوع 1 على الثلج بتركيز نهائي قدره ملغتين لكل مل.

أضف صبغة الفلورسنت بتركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل مليلتر. اخلطي المحلول واحتضنه على الثلج لمدة خمس دقائق محمية من الضوء. بعد ذلك أضف 50 ميكرولترا من الثلج البارد 10x PBS.

ثم أضف 6.25 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم المثلج البارد. أضف الماء المعقم للحصول على التركيز الصحيح واخلط المحلول. ضع إدخالات غرفة Boyden في طبق ثقافة الخلايا متعدد الآبار.

أضف 100 ميكرولتر من الكولاجين محلول واحد لكل إدراج. لبلمرة هلام الكولاجين ، احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أضف وسط زراعة الخلايا المخصب بالمصل إلى كل بئر وضع الحشوات في الوسائط.

بذرة 30،000 خلية في وسائط خالية من المصل فوق جل الكولاجين. لإصلاح الخلايا ، أضف 4٪ محلول بارافورمالدهايد في بئر فارغ. قم بإزالة وسط الخلية من الملحق دون لمس جل الكولاجين.

ضع الملحق في الآبار مع محلول 4٪ بارافورمالدهيد وأضف محلول بارافورمالدهيد إضافي 4٪ فوق هلام الكولاجين. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت ، قم بإزالة محلول 4٪ paraformaldehyde واغسله باستخدام 1x PBS.

بعد الغسيل ، يجب أن يصبح جل الكولاجين شفافا. الآن الإدخالات جاهزة للتألق المناعي. قم أولا بتصريف الإدخالات.

ثم ضع الإدخالات في آبار جديدة من لوحة متعددة الآبار. لاختراق الخلايا ، أضف محلول 0.2٪ Triton X-100 في 1X PBS فوق جل الكولاجين لمدة 30 دقيقة. استنزاف الحشوات.

يغسل باستخدام 1X PBS ويضاف محلول الأجسام المضادة الأساسي فوق جل الكولاجين لمدة ساعة واحدة محمي من الضوء. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأولي ، واغسله باستخدام 1X PBS واحتضان هلام الكولاجين بمحلول الجسم المضاد الثانوي لمدة 1.5 ساعة محميا من الضوء. اغسل محلول الأجسام المضادة الثانوية باستخدام 1X PBS.

لتحضير جل الكولاجين للتركيب ، قم بقطع غشاء الإدخال بمشرط. ضع جل الكولاجين المتصل بالغشاء في طبق زجاجي القاع. من المهم أن يكون الجزء العلوي من الجل على اتصال بقاع الطبق.

أضف وسائط التثبيت وغطاء في الأعلى لمراقبة الفحص المجهري. باستخدام هذا الفحص ، أظهرنا الدور الرئيسي لمستقبل DDR1 في غزو الخلية في هلام الكولاجين الواحد. يمكن استخدام هذا الاختبار أيضا لتقييم تأثير الأدوية على غزو الخلايا.

في دراستنا المختلفة ، أظهرنا أن مجرد إضافة عنصر جديد من المصفوفة خارج الخلية في تأكيدها الفسيولوجي ، هنا ألياف الكولاجين من النوع 1 ، يمكن أن يعدل التشكل والتركيب الجزيئي ونشاط الجسيمات الغازية. لذا باستخدام المقايسات المختلفة الموصوفة في هذا الفيلم ، أظهرنا وجود هياكل جديدة ، تنظيم جديد للغازية أطلقنا عليه اسم الغازات الخطية. من خلال توليد مصفوفات معقدة وأكثر فسيولوجية ، نسمح بتحديد المسارات الجديدة التي تنطوي على إضافة الخلايا والهجرة والغزو.