بروتوكول الأمثل لتحليل تحلل السكر والميتوكوندريا التنفس في الخلايا اللمفاوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس عملية تحلل السكر والتنفس الميتوكوندري بدقة في الخلايا اللمفاوية باستخدام مقايسة التدفق خارج الخلوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التمثيل الغذائي المناعي، مثل التغيرات الأيضية التي تحدث في الخلايا المناعية عند التنشيط، أو التمايز، أو أثناء المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح التحليل الفعال وفي الوقت الفعلي للملفات الأيضية لأكثر من 90 عينة في المرة الواحدة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول عملية التمثيل الغذائي للخلايا اللمفاوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على خلايا أخرى، بما في ذلك الخلايا غير الملتصقة التي تتطلب الإضافة إلى الطبق مع ضمان حد أدنى من الاضطراب في وظائفها. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن الخلايا اللمفاوية هشة، وتتطلب تعاملاً رقيقاً للحفاظ على وظائفها وحيويتها. في اليوم السابق للتجربة، قم برفع خرطوشة الاستشعار الخاصة بمحلل التدفق خارج الخلوي واملأ كل بئر في طبق المرافق بـ 200 µL من محلول المعايرة.

بعد ذلك، قم بخفض الخرطوشة على اللوح، بحيث تغمر المستشعرات في محلول المعايرة، ثم قم بتحضين الخرطوشة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C بدون ثاني أكسيد الكربون أو النيتروجين طوال الليل. في صباح اليوم التالي، قم بطلاء كل بئر من لوح مقايسة مكون من 96 بئراً بـ 25 µL من المحلول اللاصق، وحضّن اللوح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. في نهاية فترة التحضين، قم بشفط المحلول اللاصق واغسل كل بئر مرتين باستخدام 200 µL من الماء المعقم.

أثناء جفاف الطبق في الهواء، ضع مصفاة خلايا بمسام 70 ميكرون فوق أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وانقل الأعضاء المحصودة إلى المصفاة. وباستخدام مكبس من حقنة معقمة سعة ثلاثة ملليلتر، قم بهرس الأنسجة عبر المصفاة مع الحفاظ على رطوبة المصفاة والأعضاء طوال عملية الهرس من خلال إضافة منظم MS عند الضرورة. بعد ذلك، اشطف المصفاة من خمسة إلى 10 ملليلتر من منظم MS، متبوعاً بطرد مركزي لمعلق الخلايا الناتج.

أعد تعليق الراسب في خمسة ملليلتر من ACK red blood cell lysis buffer. بعد مرور خمس دقائق على الثلج، استعد الكثافة بإضافة 10 إلى 20 ملليلتر من MS buffer ثم قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى. عند انتهاء عملية الطرد المركزي، ضع مصفاة خلايا بمسامية 30 ميكرون فوق أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وقم بتحضير المصفاة باستخدام ملليلتر واحد من MS buffer.

أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من منظم MS الطازج وقم بترشيح معلق الخلايا عبر المصفاة لإزالة تجمعات خلايا الدم الحمراء المتحللة. أضف أربعة ملليلتر من منظم MS الطازج لشطف أنبوب التحلل الفارغ ومرر سائل الغسيل عبر المصفاة. قم بعد الخلايا وتوزيع عدد مناسب من الخلايا الطحالية (splenocytes) من أجل مقايسة التدفق خارج الخلوي (extracellular flux assay).

ثم قم بترسيب مجموعتي الخلايا، مع إعادة تعليق عينة الخلايا الطحالية الخاصة بمقايسة التدفق خارج الخلوي في 5 mL من وسط RF 10 على الثلج. أعد تعليق الخلايا المخصصة للعزل باستخدام الخرز في الأحجام المناسبة من كوكتيل أجسام مضادة للبيوتين، وخرز ميكروبية مضادة للبيوتين، ومحلول MS buffer لفترات التحضين المحددة عند درجة حرارة تتراوح بين 2 إلى 8 °C. وفي نهاية فترة التحضين الثانية، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الراسب في 500 µL من محلول MS buffer الطازج لكل 1 × 10⁸ خلية.

بعد ذلك، قم بتحميل العمود المناسب على مغناطيس الفصل، وقم بتجهيز العمود باستخدام 3 mL من منظم MS، مع التخلص من السائل المتدفق. ضع أنبوبة مخروطية معقمة سعة 15 mL تحت العمود، ثم قم بتحميل كامل حجم عينة الخلايا في العمود. بعد ذلك، اشطف أنبوبة حضانة الخلايا باستخدام 3 mL من منظم MS الطازج، مع تجميع سائل الغسيل في الأنبوبة المخروطية.

بعد جمع آخر شطفة، املأ الأنبوب حتى يصل الحجم النهائي إلى 15 milliliters من MS buffer، ثم قم بطرد مركزي للخلايا المعزولة سلبيًا. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في خمسة milliliters من RF 10 medium طازج على الثلج. وفي غضون ثلاث ساعات كحد أقصى من عملية العزل، قم بطرد مركزي لجميع عينات الخلايا، وأعد تعليق الرواسب في خمسة milliliters من وسط المقايسة المناسب لإجراء عملية طرد مركزي أخرى.

بعد عملية الطرد المركزي الثانية، أعد تعليق الرواسب بالتركيز التجريبي المناسب للوصول إلى حجم نهائي قدره 180 microliters من الخلايا لكل بئر في وسط مقايسة جديد، ثم وزع 180 microliters من الخلايا في كل بئر من آبار الطبق. حضّن الخلايا عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك، قم بطرد الطبق مركزياً لتثبيت الخلايا بإحكام في قاع الآبار، ثم أعِد الطبق إلى الحاضنة.

بعد مرور 30 دقيقة، استخدم ماصة دقيقة لتحميل المركبات المراد دراستها، والمجهزة حديثاً عند درجة حرارة 37 درجة Celsius، في منافذ الحقن المناسبة في خرطوشة مستشعر محلل التدفق خارج الخلوي، مع تحميل أي منافذ تحكم خلفية أو منافذ غير تجريبية بالوسط الغذائي وحده. أعد الخرطوشة المحملة إلى الحاضنة وقم بإعداد برنامج مقايسة التدفق خارج الخلوي. ثم قم بتحميل الخرطوشة وبدء البرنامج، مع استبدال لوحة المعايرة بلوحة المقايسة بعد انتهاء المعايرة وفقاً للتوجيهات.

بعد الانتهاء من مقايسة التدفق خارج الخلية، انتقل إلى قياسات محتوى البروتين. تكون نسبة الحيوية في جميع المجموعات الخلوية أعلى من 90%، مع ملاحظة درجة نقاء تتراوح بين 98 و99% للخلايا اللمفاوية. ويرتبط مستوى التلاقي لكل نوع من الخلايا بكثافات الزرع الأولية.

ترتبط تركيزات بروتين المُحلل طردياً مع كثافات الزرع، مما يؤكد إمكانية استخدام تركيزات البروتين لمعايرة بيانات التدفق خارج الخلوي بدقة. وترتبط أعداد الخلايا المرتفعة بمعدل استهلاك أكسجين مقاس أعلى، وكذلك باستجابات أكثر حدة للمثبطات الميتوكوندريالية. وتؤدي كثافات الزرع الأعلى إلى قياسات مماثلة لمعدل استهلاك الأكسجين المُعاير في الخلايا التائية والخلايا الطحالية، بينما يؤدي زرع 5 و1.25 × 10⁵ خلية لكل بئر إلى قياسات مماثلة لمعدل استهلاك الأكسجين المُعاير في الخلايا البائية.

ترتبط معلمات التنفس الميتوكوندري أيضًا ارتباطًا خطيًا بكثافات الزرع. بالإضافة إلى ذلك، يشير تسرب البروتونات المنخفض إلى أن معظم التنفس الأساسي يُستخدم في تخليق ATP. وتؤدي كثافات الزرع الأعلى إلى معدلات تحمض خارج خلوية أعلى واستجابات أكبر لمثبطات الميتوكوندريا.

ترتبط معلمات تحلل السكر ارتباطاً خطياً بكثافات زرع الخلايا، حيث تبين أن كثافة الزرع العالية هي الأكثر مثالية لإجراء مقايسة إجهاد تحلل السكر بنجاح. يحفز الجلوكوز التنفس الميتوكوندري بشكل طفيف، وهو ما يتم تثبيطه بواسطة oligomycin، بينما لا يؤثر 2-DG بشكل ملحوظ على استهلاك الأكسجين. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ست إلى ثماني ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقاء الخلايا على الثلج قبل تحليل التدفق خارج الخلية، والقيام بعدّ الخلايا وزرعها بدقة. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل قياس الجهد الميتوكوندري وامتصاص الجلوكوز للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالحالة الأيضية للخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا اللمفاوية وإجراء مقايسة التدفق خارج الخلية.