كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال مجسات كيميائية على وجه التحديد في جزء من الجسم المضاد عن طريق دمج حمض أميني يحتوي على أزيد وراثيا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الكيميائية مثل تعديل البروتين والهندسة والاقتران. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إدخال المسبار أو المرق المستهدف على وجه التحديد في البروتينات أو الأجسام المضادة عن طريق الخلط البسيط.

بعد بناء البلازميدات ، أضف ميكرولتر واحد من كل منها إلى 20 ميكرولترا من الإشريكية القولونية سلالة DH10-beta بتركيز اثنين في 10 إلى ثماني خلايا لكل ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. استخدم ماصة لخلط المحلول برفق. ثم ضع 20 ميكرولترا من المحلول المختلط في كوفيت نظيف.

اضبط آلة التثقيب الكهربائي على 25 ميكروفاراد و 2.5 كيلو فولت. ثم أدخل الكوفيت في شريحة الغرفة الصادمة. ادفع الشريحة إلى الغرفة حتى تتلامس الكوفيت بقوة مع أقطاب الغرفة.

اضغط على زر النبض مرة واحدة حتى تصدر آلة التثقيب الكهربائي صفيرا. بعد ذلك ، أضف مليلتر واحد من وسط SOC إلى الكوفيت بسرعة. ثم انقل الخليط إلى أنبوب اختبار.

احتضان مع الاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد اكتمال الحضانة ، انشر خلايا الإشريكية القولونية المحولة على ألواح أجار مرق ليزوجيني التي تحتوي على مضادات حيوية مناسبة. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.

بعد اكتمال حضانة الصفيحة ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة محولة في خمسة ملليلتر من وسط LB الذي يحتوي على مضادات حيوية. احتضن مع الرج لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم انقل المزرعة الأولية إلى 200 مل من وسط LB مع 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين وتركيز بؤري أذهيل واحد. احتضان مع الاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات على الأقل.

أضف ملليلترين من 1.6 مولار أرابينوز عندما تصل المزرعة إلى كثافة بصرية تبلغ 0.8 عند 550 نانومتر. ثم احتضان مع الرج عند 30 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. عند اكتمال الحضانة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 11 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية وقم بتجميد الحبيبات عند سالب 20 درجة مئوية. عندما تكون جاهزا لتحلل الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من محلول التحلل البارابلازمي في أنبوب طرد مركزي جديد. احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لخلية التحلل عند 18 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات. ثم أضف 400 ميكرولتر من معلق راتنج Ni-NTA.

باستخدام دوار ، حرك الأنبوب برفق لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد اكتمال الخلط ، اسكب التعليق في عمود البولي بروبلين. اغسل الراتنج ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من محلول الغسيل.

قم بإزالة الجسم المضاد المستهدف ب 300 ميكرولتر من محلول الشطف. بعد ذلك ، حدد تركيز البروتين المتحور كما هو موضح في بروتوكول النص. ابدأ بإضافة 10 ميكرولترات من محلول 10 ميكرومولار من HerFab-L177AF في مخزن الفوسفات الذي يحتوي على 10 ملليمولار فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة و 100 مللي مولار كلوريد الصوديوم إلى أنبوب طرد مركزي جديد.

ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول 200 ميكرومولار من Cy 5.5 azadibenzocyclooctyne في الماء. بعد ذلك ، قم بتغطية وعاء التفاعل بورق الألمنيوم. اسمح لتفاعل الإصدار الحلقي الذي يتم الترويج له بالبقع بالاستمرار لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية.

بمجرد اكتمال التفاعل ، أضف 30 ميكرولتر من العينة و 450 ميكرولتر من عازلة الفوسفات لغسل صبغة Cy 5.5 الحرة في عمود دوران مرشح الطرد المركزي. الطرد المركزي عمود الدوران عند 14 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تخلص من التدفق ثم انقل العينة المنقاة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتخزين HerFab المنقى المسمى على أربع درجات مئوية ما لم يكن جاهزا للتحليل. ابدأ بإضافة 13 ميكرولترا من 7.8 ميكرومولار منقى HerFab إلى أنبوب جديد. ثم أضف خمسة ميكرولترات من عينة البروتين LDS.

احتضان الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بإرفاق كاسيت الجل الأربعة إلى 12٪ Bis-Tris SDS-PAGE بخلية الرحلان الكهربائي. إضافة المخزن المؤقت قيد التشغيل.

بعد ذلك ، قم بتحميل عينات البروتين المترافق في صانع الوزن الجزيئي الملون مسبقا. قم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام لمدة 35 دقيقة عند 200 فولت. بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، انقل الجل إلى نظام توثيق وتحليل الهلام.

امسح بحثا عن Cy 5.5 ثم قم بتلطيخ الجل ببقعة بروتين تجارية. في هذه الدراسة ، يتم اقتران جزء الجسم المضاد Her-Fab على وجه التحديد مع أ يتم تحقيق ذلك عن طريق دمج حمض أميني يحتوي على أزيد في الجزء ثم تفاعل جزء الجسم المضاد المتحور مع سيكلوكتين متوتر. يتم إجراء تحليل SDS-PAGE للبروتينات الطافرة المعبر عنها مع وبدون الأحماض الأمينية المحتوية على الأزيد.

كما يتضح ، تم الحصول على جزء الجسم المضاد كامل الطول فقط في وجود الحمض الأميني. يتم تقييم الجسم المضاد الذي يحتوي على الحمض الأميني للاقتران عن طريق التفاعل مع مشتق azadibenzocyclooctyne المرتبط ب Cy 5.5 Cy 5.5 وتحليله بواسطة SDS-PAGE. تظهر صور التألق اقتران جزء الجسم المضاد المتحور مع Cy 5.5 بينما لم يلاحظ أي اقتران في السيطرة.

بمجرد التعبير عن البروتين وتنقيته بشكل صحيح باستخدام أسيتيل فينيل ألانين ، يمكن تصنيف البروتين بكفاءة باستخدام مسبار بالإجهاد نظرا لأن تفاعل الملصقات لا يتطلب أي كاشف إضافي ، يمكنك إدخال المسبار في البروتين المستهدف ببساطة عن طريق خلط المسبار مع البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إدخال مسبار كيميائي على وجه التحديد في جزء من الجسم المضاد عن طريق دمج حمض أميني يحتوي على أزيد وراثيا.