مكون للغضروف التمايز تحريض الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الجاذبية الطرد المركزي
فبراير 24, 2017
يمكن أن يؤدي الإجهاد الميكانيكي إلى التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية ، مما يوفر نهجا علاجيا محتملا لإصلاح الغضروف الضعيف. نقدم بروتوكولا للحث على التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) باستخدام جاذبية الطرد المركزي (CG). يؤدي التنظيم الناجم عن CG ل SOX9 إلى تطوير أنماط ظاهرية غضروفية المنشأ.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث تمايز غضروفي لحالة ASC لإصلاح الغضروف المعيب. هذه الطريقة هي إحداث التمايز المسبق الغضروفي ل ASC باستخدام قوة الجاذبية الطرد المركزي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتمايز الغضروفي ل ASC ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل التمايز العظمي والليفي.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إحداث التمايز الغضروفي بسهولة من الخلايا الجذعية دون علاج أي سيتوكينات. سيتم توضيح الإجراء من ييري أليس ريم ويوجون نام من مختبري. ابدأ بحصاد 80٪ من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون المتجمعة من طبق استزراع 100 مل عن طريق التخلص من الوسط وغسله بخمسة ملليلتر من PBS.
ثم أضف ملليلترا واحدا من PBS يحتوي على EDTA مليمولار واحد ، واحتضانه لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد دقيقتين ، اضغط على لوحة الثقافة برفق ثم أضف أربعة ملليلتر من الوسط الطازج وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 250 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. ثم أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من المتوسط. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
لتحميل الجاذبية بالطرد المركزي ، انقل 2.5 في عشرة إلى الخلايا الخامسة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 2400 مرة جم لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، انتقل إلى ثقافة الحبيبات أو الكتلة الدقيقة. مباشرة بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية و 500 ميكرولتر من وسط التمايز الغضروفي ، أو CDM ، و 50 ميكروغرام لكل مليلتر من حمض الأسكوربيك 2-الفوسفات المحضر حديثا إلى الحبيبات.
تحكم إيجابي ، يحفز التمايز الغضروفي ويجمع خلاياه عن طريق إضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام لكل مليلتر TGF-beta-1. قم بتغطية الأنابيب بشكل غير محكم واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أسابيع. مباشرة بعد الطرد المركزي لتحميل الجاذبية ، قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من آلية التنمية النظيفة.
لتشكيل كتلة صغيرة ، قم بإدخال الخلايا المعاد تعليقها في وسط بئر من صفيحة 24 بئرا ثم ضع اللوحة في الحاضنة. بعد ساعتين ، أضف بعناية 500 ميكرولتر من CDM إلى البئر ، مع سحب العينات على جدار اللوحة لتجنب تعطيل الكتلة الصغيرة. كعنصر تحكم إيجابي ، قم بإجراء ثقافة الكتلة الدقيقة مع خلايا غير مطرد مركزية عن طريق إضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام لكل مليلتر من TGF-beta-1.
احتضان الكتلة الدقيقة لمدة ثلاثة أسابيع. في اليوم 21 بعد تكوين الكتلة الدقيقة ، استخدم ماصة لحصاد الكريات الكروية ، ثم اغسلها باستخدام 1X PBS. قم بإصلاح الكريات الكروية عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، تخلص من المثبت واشطف كريات الخلية بالماء منزوع الأيونات. ضع طبقة واحدة من الشاش على كاسيت الأنسجة وانقل الكريات الكروية الثابتة باستخدام ماصة. قم بتغطية الحبيبات عن طريق طي الشاش وأغلق غطاء الكاسيت.
بعد ذلك ، قم بتجفيف الكريات الكروية عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم استمر في سلسلة من تركيزات الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل منها. ثم اغمر الكريات في 100٪ زيلين لمدة 15 دقيقة.
اغمر الكريات الكروية في البارافين عند 56 درجة مئوية للتضمين. بعد ذلك ، قم بقطع خمسة أقسام بسمك ميكرون من حبيبات الخلية المضمنة في البارافين باستخدام ميكروتوم دوار. قم بتعويم الأقسام بنسبة 50٪ من الإيثانول ، ثم انقلها إلى حمام مائي 50 درجة مئوية.
قم بتركيب الأقسام العائمة على الشرائح ، ثم انتقل إلى safranin o و alcian blue لتلوين فلورسنت المناعي. لتحديد قوة جاذبية الطرد المركزي المناسبة ، تم نسج ASC عند جاذبية الطرد المركزي صفر ، 300 ، 600 ، 1 ، 200 ، و 2 ، 400 مرة جم لمدة خمس عشرة دقيقة. تم تقييم تعبير SOX9 mRNA في 24 ساعة بعد تحفيز CG.
تسبب CG 2 ، 400 مرة جم بشكل كبير في تعبير SOX9 mRNA. لتقييم التعبير عن الجينات المرتبطة بتكوين الغضروف ، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من ASC غير المحفز ، ASC التي تم طردها بالطرد المركزي ، أو معالجتها باستخدام TGF-beta-one. كما هو موضح هنا ، يحفز تحفيز CG الكولاجين من النوع 2 والتعبير التراكمي.
تم تأكيد الإفراط في التعبير عن الكولاجين من النوع 2 في ASC المعالج ب CG عن طريق الفلور المناعي باستخدام جسم مضاد ضد الكولاجين من النوع 2 في الجسم المضاد الثانوي المترافق Alexa Fluor 594. لتحديد تأثير CG على الإفراط في التعبير عن ECM المرتبط بتكوين الغضروف ، تم التعامل مع ASC باستخدام TGF-beta-one كعنصر تحكم إيجابي. كانت المراقبة السلبية عبارة عن ثقافة حبيبات لا تخضع لتحميل CG ، أو معالجة TGF-beta-one.
تم تقييم الإفراط في التعبير عن ECM المرتبط بتكوين الغضروف في الكريات الكروية التي تتكون من ASC بالطرد المركزي من خلال استخدام السافرانين o والتلوين الأزرق الألسياني. كان الجليكوزامينوجليكان ، وهو مكون رئيسي للغضروف المفصلي ، ملطخا باللون الأزرق الألسيا ، أو برتقاليا ملطخا بسافرانين O. بعد 14 يوما من زراعة الكتلة الدقيقة ، تم تقييم تكثيف الخلايا الغضروفية حسب حجم الركام.
كان حجم كل ركام ، تم إنشاؤه بواسطة CG ، حوالي 0.5 ملم. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية باستخدام قوة الجاذبية بالطرد المركزي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتحفيز التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) باستخدام الجاذبية المركزية (CG). تسلط الطريقة الضوء على إمكانات الضغط الميكانيكي في إصلاح الغضاريف عن طريق تعزيز التعبير الصاعد عن SOX9، مما يؤدي إلى تطور الأنماط الظاهرية الغضروية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- إصلاح الغضاريف
- آثار الضغط الميكانيكي
الخلفية
- التمايز الغضروفي ضروري لإصلاح الغضاريف.
- الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) هي مصدر واعد للعلاجات التجديدية.
- يمكن أن تؤثر القوى الميكانيكية على تمايز الخلايا الجذعية.
- SOX9 هو عامل نسخ رئيسي في التمايز الغضروفي.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لتحفيز التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون.
- استكشاف تأثيرات الجاذبية المركزية على تمايز الخلايا الجذعية.
- توفير نهج خالٍ من السيتوكينات لإصلاح الغضاريف.
الطرق المستخدمة
- حصاد الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من أطباق الثقافة.
- تطبيق الجاذبية المركزية لتحفيز التمايز.
- تقييم التعبير عن العلامات الغضروفية.
- توضيح الإجراء من قبل موظفي المختبر.
النتائج الرئيسية
- تحريض ناجح للتمايز الغضروفي في الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون.
- التعبير الصاعد عن SOX9 الذي لوحظ بعد العلاج.
- تأكيد تطور الأنماط الظاهرية الغضروفية.
- ملاحظة التطبيقات المحتملة في مسارات التمايز الأخرى.
الاستنتاجات
- الجاذبية المركزية هي طريقة فعالة لتحريض التمايز الغضروفي.
- قد تعزز هذه التقنية استراتيجيات إصلاح الغضاريف.
- قد توسع الأبحاث الإضافية تطبيقها على عمليات تمايز الخلايا الجذعية الأخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Mechanical induction of chondrogenic differentiation offers a cytokine-free alternative for cartilage repair, reducing contamination risks and process complexity in stem cell-based therapies. This approach supports target validation by enabling functional assessment of chondrogenic potential in adipose-derived stem cells under defined biomechanical conditions. The method provides a scalable, reproducible system for early-stage de-risking of cartilage regeneration strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of SOX9 upregulation as a mechanistic readout for chondrogenic commitment in stem cells.
- Operational Value: Provides a cytokine-free induction system that minimizes variability and contamination risk in differentiation assays.
- Predictive Value: Supports assessment of chondrogenic phenotype through marker expression (ACAN, COL2A1) and aggregate formation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized chondrogenic aggregates suitable for downstream ECM and histological analysis.
- Quantitative Output: Enables measurement of glycosaminoglycan deposition via safranin O and alcian blue staining.
- Scalability: Uses conventional centrifugation equipment, facilitating integration into existing laboratory workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early chondrogenic events critical for articular cartilage repair strategies.
- Mechanistic De-risking: Avoids hypertrophic differentiation markers (COL10), supporting evaluation of stable chondrocyte phenotypes.
- Translational Continuity: Bridges in vitro differentiation with preclinical evaluation through spheroid pellet formation and histological validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical modeling by providing a biomechanical induction system for chondrogenesis.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that mechanical stress can substitute for biochemical inducers in stem cell differentiation.
- Screening: Produces reproducible micromass cultures for compound or condition testing in chondrogenesis.
- Analytics: Delivers quantifiable readouts including SOX9, ACAN, COL2A1 expression and histological staining intensity.
- Translational Research: Supports progression to preclinical models by generating stable chondrogenic pellets without hypertrophic markers.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other differentiation lineages (osteogenic, fibrogenic) using the same centrifugal gravity platform.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating mechanical stress as a differentiation inducer.
- Operational Value: Eliminates cytokine dependency, simplifying reagent logistics and reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of chondrogenic potential in stem cell sources.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cartilage repair candidates through predictive phenotypic screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and histological processing.
- Depends on access to calibrated centrifuges capable of 2,400 × g.
- Necessitates standardization of cell seeding density and centrifugation timing across laboratories.
- Requires adaptation of chondrogenic medium formulation when applying to different stem cell sources.
- Limited to in vitro models; does not replace in vivo validation of cartilage integration or function.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Centrifugal Gravity Loading
2:22
Pellet Culture
3:12
Micromass Culture
4:10
Paraffin-embedding Cell Pellets
5:59
Results: Upregulation of Chondrogenic Differentiation Markers in Adipose-derived Stem Cells Following Centrifugal Gravity Loading
7:59
Conclusion
