حمل إصابة نقص التروية ضخه في الجلد الأذن ماوس لحيوي داخلي Multiphoton التصوير من الاستجابات المناعية

الهدف العام من هذه التجربة هو فهم كيفية استجابة الخلايا المناعية لإعادة تروية نقص التروية من خلال التصوير متعدد الفوتون داخل الحيوية لجلد أذن الفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة بعض الأسئلة المهمة جدا في مجال المناعة والأمراض الجلدية لفهم السلوك الديناميكي للخلايا المناعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر نموذج تصوير قوي لدراسة الأنشطة الخلوية في الجلد تحت حالة الالتهاب أو الراحة.

على الرغم من أن هذه الطريقة قد توفر نظرة ثاقبة لإصابات التروية الإقفارية ، إلا أنه يمكن تطبيق ذلك أيضا على أنظمة أخرى مثل تفاعلات فرط الحساسية وكذلك العدوى. لبدء هذا الإجراء ، ضع الماوس على وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة جسمه عند 37 درجة مئوية طوال عملية التحضير. تأكد من عمق التخدير من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.

بعد ذلك ، ضع زيوت تشحيم العين على عيون لمنع الجفاف أثناء التخدير. بعد ذلك ، ضعي كريم إزالة الشعر بعناية على الثلثين العلويين من الأذن الظهرية وانتظري لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. ثم قم بإزالة الكريم باستخدام أدوات تطبيق القطن المبللة بطريقة شاملة ولكن لطيفة.

الآن ، قم بتحفيز نقص التروية في جلد أذن الفأر باستخدام مغناطيس النيوديميوم. للقيام بذلك ، قم أولا بإدخال المغناطيس في أدلةها البلاستيكية الفردية. ضع مغناطيسا واحدا بحيث تتلامس الحافة فقط مع مغناطيس بطني ثان ، والذي يجب وضعه أسفل الجانب البطني للأذن مع وضع الأذن بشكل مسطح على المغناطيس.

بمجرد أن تصبح جاهزا ، دع المغناطيس يجتمع بعناية. بعد 1.5 ساعة من نقص التروية ، قم بإزالة المغناطيس عن طريق لفه بعيدا عن بعضه البعض باستخدام الأدلة البلاستيكية ، مما يسمح بحدوث إعادة التروية. مباشرة بعد إزالة المغناطيس ، قم بإعطاء Evans Blue أو أي عامل آخر لوضع العلامات على الأوعية الدموية عن طريق الوريد.

في هذه الخطوة ، قم بقص قطعتين من الشريط اللاصق. اسمح للجوانب اللاصقة بالالتصاق ببعضها البعض مع ترك حوالي ملليمتر واحد من المادة اللاصقة على طول عرضها. بعد ذلك ، قم بقص الشريط اللاصق إلى قسمين لاستيعاب وضعه داخل الشق على منصة الأذن.

أدخل هذا الشريط اللاصق في منتصف الطريق تقريبا من خلال الشق بحيث يكون الجانب اللاصق متجها لأعلى. بعد ذلك ، ضع الماوس على وسادة التسخين بحيث تكون الأذن المراد تصويرها بجوار شريط الشريط اللاصق. باستخدام اثنين من أدوات تطبيق القطن المبللة PBS ، اضغط برفق على الأذن على الشريط اللاصق.

باستخدام الشريط كدليل ، قم بإحضار أذن الماوس من خلال الشق مع ضبط الماوس في نفس الوقت بالقرب من المسرح. نظرا لأن جلد الأذن هش للغاية ، يجب القيام بهذه الخطوة بعناية فائقة لتجنب أي إصابات ناتجة عن التحضير. لإزالة الشريط اللاصق ، أضف أولا قطرة من PBS لتقليل التصاق الشريط.

بعد ذلك ، افصل أذن الماوس عن الشريط اللاصق بلطف قدر الإمكان باستخدام فرشاة طلاء دقيقة. افرد الأذن على منصة الأذن عن طريق لف قضيب طرف قطني رطب برفق فوق الأذن. بعد ذلك ، ضع قطرة من PBS أسفل الغطاء وضعها برفق على الأذن.

بعد ذلك ، أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم وقم بتوصيل الأسلاك بنظام التدفئة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. للحصول على الصور ، ضع تحت المجهر متعدد الفوتونات. ابدأ بمنطقة تصوير قريبة من حافة نقص التروية التي تتميز بتسرب إيفانز الأزرق الهائل.

الرسم البياني التخطيطي هنا موضع المغناطيس. تظهر هاتان الصورتان أذنا ما قبل الإقفار وما بعد الإقفار بعد تثبيت المغناطيس. يشير هذا الرسم التخطيطي للأذن إلى المنطقة المصورة فيما يتعلق بمكان وضع المغناطيس.

يظهر تسلسل الفاصل الزمني هذا للإسقاط الأقصى تسلل العدلات استجابة لإعادة التروية في جلد أذن الفأر ألبينو LysM-eGFPM بعد 1.5 ساعة من نقص التروية. في النقاط الزمنية السابقة ، يشير عدم وجود إشارة إيفانز الزرقاء إلى انسداد مؤقت للأوعية الدموية بعد نقص التروية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الاستعدادات للأذن الإقفارية المعاد تكريمها للتصوير في أقل من 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم التحقق باستمرار من عمق التخدير ودرجة حرارة الماوس. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى مثل تلطيخ الفأر بالكامل لجلد أذن الفأر للحصول على رؤية عالمية للتوطين الخلوي. بعد تطورات هذا البروتوكول ، مهد الطريق للباحث في مجال المناعة والأمراض الجلدية لاستكشاف المناعة الفطرية في جلد أذن الفأر.

بعد مشاهدة مقاطع الفيديو هذه ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نموذج تصوير جلد أذن الفأر لدراسة إصابة إعادة التروية الإقفارية. لا تنس أن العمل باستخدام المجهر متعدد الصور يمكن أن يكون خطيرا. ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل التدريب على السلامة بالليزر.