باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب في المختبر

الهدف العام من هذه التقنية هو التقاط تفاعلات البروتين الدهني القريب في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال ديناميكيات الميتوكوندريا ، مثل كيف يمكن أن تتأثر تفاعلات البروتين والبروتين في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بالدهون الملحقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن ربط مجالات البروتين القابلة للذوبان بقوالب الدهون يضمن إمكانية تحقيق تأكيد أصلي.

علاوة على ذلك ، يمكن تقييم التفاعلات المعقدة بين البروتينات القابلة للذوبان وشركائها المربوطين في وجود عوامل مساعدة دهنية محددة. على الرغم من أننا نستخدم هذه الطريقة للتحقيق في تفاعلات البروتين في آلية انشطار الميتوكوندريا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على مجمعات البروتين الأخرى التي تتمركز في مقصورات غشائية متنوعة. سيوضح هذا الإجراء رايان ، طالب دراسات عليا من مختبري.

أولا ، امزج محاليل الكلوروفورم للدهون المرغوبة في أنبوب اختبار زجاجي نظيف. تبخر المذيب بغاز النيتروجين الجاف أثناء تدوير الأنبوب لتشكيل طبقة دهنية رقيقة. ثم قم بإزالة المذيب المتبقي باستخدام مبخر الطرد المركزي لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت A المسخن مسبقا لإعطاء تركيز دهني نهائي من واحد إلى ملليمول. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع دوامة عرضية لإعادة تعليق خليط الدهون بالكامل. بعد الحضانة ، انقل خليط الدهون إلى أنبوب اختبار بلاستيكي وضع الأنبوب في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية تقريبا حتى يتجمد تماما.

ثم ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يذوب تماما. بعد ذلك ، قم بإعداد آلة بثق الدهون عن طريق نقع أربعة دعامات مرشح وفلتر بولي كربونات في المخزن المؤقت A وتجميع الطارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بثق محلول الدهون من خلال الفلتر 21 مرة باستخدام ضغط ثابت لطيف لضمان توزيع متجانس للحجم.

أثناء البثق ، استخدم ضغطا ثابتا بطيئا لضمان تجانس حجم الجسيمات الشحمية. مع مرشح ميكرون واحد ، يكون هذا أقل أهمية. ولكن مع أحجام المرشحات الأصغر ، يمكن أن تقدم المزيد من عدم التجانس الواضح.

قم بتخزين الجسيمات الشحمية المبثوقة عند أربع درجات مئوية. احتضان عامل انشطار الميتوكوندريا الموسوم به أو Mff باستخدام الجسيمات الشحمية السقالة لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة في المخزن المؤقت A و BME. للحصول على تحكم خال من Mff ، احتضان الجسيمات الشحمية ببروتين تحكم مميز ، مثل GFP ، لربط وحماية Nickel-NTA المكشوف.

أضف البروتين المرتبط بالدينامين واحد أو Drp1 إلى خليط الجسيمات الشحمية واحتضنه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، انقل خمسة ميكرولترات من العينة إلى ورقة من فيلم المختبر ووضع شبكة من النحاس والروديوم المطلية بالكربون فوق العينة. بعد الحضانة لمدة دقيقة واحدة ، قم بإزالة السائل الزائد بورق الترشيح وأضف قطرة من أسيتات اليورانيل 2٪.

بعد الحضانة لمدة دقيقة أخرى ، قم بإزالة البقعة الزائدة بورق الترشيح ، وانقل العينة إلى صندوق شبكي. في اليوم التالي ، قم بتصوير العينات باستخدام مجهر إلكتروني ناقل عند تكبير 18 ، 500 إلى 30 ، 000X لمراقبة التغيرات البنية التحتية في أشكال البروتين والشحم. احتضان Mff و Fis1 الموسومين بالجسيمات الشحمية للسقالة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في المخزن المؤقت A و BME.

أضف Drp1 واحتضن كل خليط لمدة 15 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. انقل الأنابيب إلى جهاز التدوير الحراري المضبوطة على 37 درجة مئوية وابدأ التفاعلات بإضافة GTP وكلوريد المغنيسيوم. في النقاط الزمنية المطلوبة، انقل 20 ميكرولترا من كل خليط تفاعل إلى آبار صفيحة ميكروتيتر تحتوي على خمسة ميكرولترات من 0.5 مولار EDTA لاستخلاص المغنيسيوم وإيقاف التفاعل.

بعد ذلك ، قم بإعداد مجموعة من معايير الفوسفات عن طريق تخفيف فوسفات البوتاسيوم في المخزن المؤقت A و BME لمعايرة النتائج. أضف 20 ميكرولترا من كل معيار إلى الآبار التي تحتوي على خمسة ميكرولترات من 0.5 مولار EDTA. أضف 150 ميكرولترا من الكاشف الأخضر الملكيت إلى كل بئر.

وأخيرا، اقرأ التوجيه التنفيذي 650 بعد خمس دقائق من كل إضافة. سوف يتحلل GTP ببطء في وجود الكاشف الأخضر الحمضي الملكيت. لذلك يجب إضافة هذا الكاشف إلى جميع عينات الآبار في غضون 10 دقائق من قياس الامتصاص لزيادة الإشارة إلى الضوضاء.

في حالة عدم وجود Drp1 ، لم ينتج عن MFF ولا GFP تشوه الغشاء. وقد لوحظت الجسيمات الشحمية عديمة الملامح فقط للجسيمات الشحمية المخصبة بالسقالة المزينة ب GFP أو ESL. ومع ذلك ، عندما تمت إضافة Drp1 إلى قوالب ESL المزينة ب Mff ، كانت إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية واضحة.

زخرفة SL بنشاط GTPase محسن من MFF. على العكس من ذلك ، عندما تم حظر مجموعات رأس NTA المكشوفة باستخدام GFP الموسوم به ، تم استبعاد نشاط GTPase المعزز هذا. كما فشل ربط Fis1 الذي يفتقر إلى مجال الغشاء الخاص به إلى SL ، في تحفيز نشاط GTPase الخاص ب Drp1.

على غرار SL ، أدت إضافة SL / Cl إلى Drp1 إلى تحفيز طفيف لنشاط GTPase الذي تم عكسه عن طريق ربط Fis1 أو GFP الذي يحمل علامة His بالجسيمات الشحمية. لوحظ تآزر بين Mff و cardiolipin حيث تم تحفيز نشاط GTPase ل Drp1 بمقدار 2.6 مرة عندما تم احتضانه باستخدام SL / CL المزين ب Mff. عندما تم تزيين قوالب SL / PE / CL ب Mff ، تم تحسين نشاط Drp1.

تم تعزيز قدرة Drp1 على إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية إلى أنابيب دهنية عن طريق إضافة PE إلى الجسيمات الشحمية للسقالات. بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير هذه السقالات واستخدامها في غضون ساعات إذا تم تنفيذ الإجراء بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق تفاعل البروتين والدهون الأخرى مثل فحوصات الترسيب وتشتت الضوء من أجل توصيف التفاعلات الوظيفية.

يسمح تطبيق هذه التقنية للأشخاص الذين يفحصون انتقال البروتين إلى غشاء بيولوجي محدد لاستكشاف تفاعلات البروتين العابرة وتأثير العوامل المساعدة الدهنية المحددة في تكوين وتثبيت التجمعات الخلوية الأساسية.