تحديد موثوق المعيشة الدوبامين الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الثقافات عن طريق RNA تسلسل وTH يحركها المروج EGFP التعبير

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الخلايا العصبية الدوبامين الحية بشكل موثوق في مزارع الدماغ المتوسط باستخدام تعبير eGFP المدفوع بالتيروزين هيدروكسلاز ، وحصاد الخلية المفردة ، وتوليد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات مرض باركنسون وإدمان المخدرات ، لأنها تجعل من الممكن إجراء التعبير الجيني والمقايسات الفيزيولوجية الكهربية على الخلايا العصبية الدوبامين الحية المحددة في الثقافة. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها توفر وسيلة لتحديد الخلايا العصبية الحية بدلا من الدوبامين الثابتة بشكل موثوق في الثقافات الدماغية البطنية الأولية.

ستظهر الجزء الأول من الإجراء شارلين كيم ، فنية من مختبر هنري ليستر. ابدأ بتثبيت رأس جنين الفأر باستخدام ملقط يوضع بإحكام على الخطم ، بحيث يمكن الوصول إلى السطح الظهري. باستخدام ملقط مثبت في اليد الأخرى ، قم بقرص طبقة الجلد والجمجمة قبل حافة الدماغ المتوسط مباشرة وقشر الجلد والجمجمة على طول خط الوسط.

ضع الملقط حول التلال بطرف واحد بين القشرة والميزانسيفالون والآخر فوق المخيخ. قرصة وإزالة الدماغ المتوسط بالكامل. ضع الدماغ المتوسط في طبق بتري مع HBSS البارد تحت مجهر تشريح.

تحت مجهر التشريح ، اقلب جزء الدماغ بحيث يمكن الوصول إلى الجانب البطني الآن. يوجد الآن أربعة أرباع مرئية. قم بإزالة جميع السحايا والأوعية الدموية عن طريق الإمساك بالسحايا برفق بالملقط والسحب لأعلى بعيدا عن الدماغ.

بعد ذلك ، ضع ملقطا واحدا من الملقط في البطين تقريبا في وسط الجزء. ثم لفصل الدماغ الأوسط ، قم بعمل قرصة ظهرية ، ثم اضغط وسطيا على كل جانب. خذ الربعين السفليين عن طريق إجراء تخفيضات جانبية على كلا الجانبين.

تقع المنطقة السقيفية البطنية والمادة السوداء المضغوط في القسم السفلي البطني ، والذي يبدو كثيفا. ضع الأنسجة المقطعة التي تحتوي على كل من VTA و SNC في HBSS الطازج في منطقة منفصلة من طبق بتري. بعد تشريح جميع أجزاء الدماغ ، استخدم الملقط والمشرط رقم 11 لتقطيع كل قسم من أقسام الدماغ الأوسط إلى قطع متساوية الحجم تقريبا.

بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة P1000 عريض التجويف لنقل جميع أجزاء الدماغ المتوسط المقسمة إلى أرباع ، إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد السماح للأنسجة بالاستقرار وإزالة HBSS ، أضف 500 ميكرولتر من محلول غراء. احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، استخدم طرفا عريضا من P1000 لنقل أجزاء الدماغ المتوسط فقط إلى جزء واحد من محلول DNase I والسماح للأجزاء بالاستقرار في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، انقل أجزاء الدماغ المتوسط فقط إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من محلول التوقف البارد. استبدل الشطف الثاني بملليلتر واحد من محلول التوقف الطازج والماصة لأعلى ولأسفل سبع مرات بطرف ماصة P1000 لترثيل الخلايا.

ثم قم بوضع الأساس لتعليق الخلية عن طريق سحب 200 ميكرولتر ببطء من محلول BSA بنسبة 4٪ في قاع الأنبوب. بعد الطرد المركزي عند 280 × جم لمدة ست دقائق ، قم بشفط المادة الطافية باستخدام P1000 وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من وسط الطلاء. قم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ثم قم بتخفيف تعليق الخلية إلى 1000 خلية لكل ميكرولتر بوسط طلاء.

لوحة 120 ميكرولتر من تعليق الخلية على أطباق الثقافة المطلية ب poly-D-lysine و poly-L-ornithine و laminin مباشرة بعد شفط اللامينين ، لضمان عدم جفاف الطلاء وتشكيل سطح غير مستو. ثم ، بعد ساعة واحدة من الحضانة ، أضف بعناية ثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة إلى منطقة غير مصنفة من طبق الثقافة لتقليل اضطراب الخلايا. بعد ثلاثة أسابيع من الثقافة ، اشطف طبق الثقافة بملليلترين من Dulbecco's PBS الخالي من RNase.

قم بإزالة DPBS. ثم استبدلها بملليلتر واحد من DPBS الطازج للحصاد. استخدم مجموعة مرشح GFP وهدف 40X على مجهر epifluoresence مقلوب لتحديد الخلايا العصبية الإيجابية TH الفلورية في الثقافات.

استخدم المعالج الدقيق للماصة فوق سوما الخلية. ثم استخدم أنبوبا بلاستيكيا متصلة بالمنفذ الجانبي لحامل الماصة الدقيقة لتطبيق شفط لطيف من أجل شفط الخلايا العصبية في الماصة الدقيقة الزجاجية. قم بإزالة الماصة الدقيقة التي تحتوي على الخلية على الفور من محلول الاستحمام وضع الطرف داخل مجموعة أنبوب PCR سعة 0.2 مليلتر تحتوي على عازلة للتفاعل.

اكسر الطرف على جانب الأنبوب بالقرب من القاع. ثم ضع إبرة حقنة معقمة عيار 21 في الجزء الخلفي من الماصة الدقيقة واضغط لطرد السائل المتبقي من الطرف المكسور للماصة الدقيقة. قم بالطرد المركزي لأنبوب التجميع لمدة خمس ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق لسطح المكتب ثم قم بتجميده في الثلج الجاف.

أثناء العمل في خزانة PCR مع الكواشف على الجليد ، أو على كتلة التبريد ، قم بإعداد أول مزيج سلالة رئيسي بالإضافة إلى حجم إضافي بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة. وميكرولتر واحد من ثلاثة برايمر أولي واحد وميكرولتر واحد من مسامير الحمض النووي الريبي الكمية للعينة. ثم احتضان العينة في جهاز التدوير الحراري لمدة ثلاث دقائق عند 72 درجة مئوية ثم ضع العينات مباشرة على رف تبريد PCR.

بعد ذلك ، أضف 5.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المحضر إلى أنبوب التفاعل في رف تبريد PCR واخلطه عن طريق سحب العينة برفق. بعد الطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس ثوان ، قم باحتضان جهاز تدوير حراري مضبوطة على المعلمات المعروضة الآن على الشاشة. لتنقية الحمض النووي (كدنا) الأول ، أضف 25 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي الدوامة بدرجة حرارة الغرفة إلى العينة.

امزج عن طريق سحب الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثماني دقائق للسماح ل (كدنا) بالارتباط بالخرز. ثم ضع العينات والخرز المغناطيسي على جهاز الفصل المغناطيسي حتى يظهر السائل صافيا تماما ولا يتبقى أي حبات في المادة الطافية.

استنشق وتخلص من المادة الطافية. قم بتدوير العينة لمدة خمس ثوان لتجميع السائل من جانب الأنبوب. ضع العينات على جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 30 ثانية.

ثم قم بإزالة كل المادة الطافية المتبقية باستخدام ماصة P10 لتترك الخرز فقط مع الحمض النووي المقيد. أضف 50 ميكرولترا من المزيج الرئيسي ds-cDNA PCR ثم قم بتشغيل برنامج PCR لتوليف الخيوط الثاني للحصول على الحمض النووي (cDNA) المزدوج الذي تقطعت به السبل. يوضح هذا الرسم البياني عدد جينات ترميز البروتين التي تم اكتشافها في مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الدوبامين أحادية الخلية التي تم إنشاؤها من الخلايا الإيجابية TH-eGFP في أجزاء لكل كيلو قاعدة من النسخة لكل مليون قراءة معينة.

تم اكتشاف 6 ، 000 إلى 8 ، 000 جين بروتيني في مكتبات الخلية الواحدة. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في غضون أربعة إلى خمسة أسابيع ، بما في ذلك الوقت اللازم لاشتقاق الخلايا ، والسماح بنضوج الخلايا في الثقافة ، وحصاد الخلايا وخطوات إنشاء المكتبة ، وتسلسل المكتبات ، والتحليل الأولي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بمساحة عمل خالية من الحمض النووي الريبي لبحث الحمض النووي الريبي عن توليد المكتبة وحصاد الخلايا ، للحفاظ على التقنيات المعقمة من خلال زراعة الخلايا وصنع ماصات بقطر مناسب للخلية الواحدة.

لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام غطاء الدخان ، وتجنب ملامسة الجلد والعين ، والابتعاد عن الحرارة واللهب المكشوف ، وارتداء ملابس الحماية الشخصية المناسبة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التعبير الجيني وتحليل الشبكة الجينية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تأثير العلاجات الدوائية على التعبير عن البروتين في خلايا الدوبامين.