دراسة الميتوكوندريا هيكل وظيفة في ذبابة الفاكهة المبايض

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طرق دراسة بنية الميتوكوندريا ووظيفتها في الأنسجة الحية وكذلك في الأنسجة الثابتة في الكائن الحي ذبابة الفاكهة السوداء النموذجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الميتوكوندريا. مثل الآليات التنظيمية لوظيفة الميتوكوندريا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجري تحليلا مفصلا لعلاقة بنية الميتوكوندريا / الوظيفة. بعد فرز خمس إناث ذباب مخدر وفقا لبروتوكول النص ، تحت مجهر التشريح ، استخدم زوجين من الملقط لفصل الصدر عن البطن. ثم انقل البطن بعناية إلى البئر الثاني من الطبق.

باستخدام زوج واحد من الملقط لتثبيت البطن في الطرف الخلفي ، استخدم الزوج الآخر من الملقط لدفع المبايض ببطء للخارج. ثم استخدم الملقط لتثبيت مبيض فردي من الطرف الخلفي غير الشفاف وانقله بعناية إلى البئر الثالث من الطبق لإغاظته أو تثبيته. قم بإثارة الغلاف الواقي بعناية من حول المبايض ، باستخدام زوج من الملقط لتثبيت الطرف الخلفي ومسح إبرة إغاظة برفق من الخلف إلى النهاية الأمامية.

لتحضير غرف مطلية بالبولي ليزين ، ضع قطرتين منفصلتين سعة 20 ميكرولتر من البولي ليزين على زجاج الغطاء لطبق بتري ذو قاع زجاجي. جفف الألواح بالهواء عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، وحدد البولي ليسين على الجانب السفلي من اللوحة. اضبط معلمات المسح على المجهر متحد البؤر عن طريق فتح برنامج الحصول على الصور ، وفي علامة تبويب الاقتناء ، قم بتعيين معلمات المسح المناسبة.

تحقق من مربعات السلاسل الزمنية والتبييض والمناطق لفتح علامات التبويب الفردية. بعد ذلك، أدخل قيم معلمات الاكتساب المناسبة في كل علامة تبويب. بعد ذلك ، ضع مبيضا واحدا مقطوع ومزعجا على منطقة مطلية بالبولي ليسين واستخدم إبرة إغاظة لنشر المبيض وفصل المبيض.

ضع قطرة 10 ميكرو لتر من وسط تشريح الحشرات فوق المبيض ، مع التأكد من تغطية المنطقة المطلية بالبولي ليسين بالكامل. ثم غطي طبق بتري. مباشرة بعد تركيب المبيض ، ضع العينة على مرحلة المجهر واستخدم قطعة العين لتحديد مجال الاهتمام في الأنسجة الحية بسرعة.

انقر فوق بث مباشر للحصول على صورة حية لمجال الاهتمام المحدد، ثم انقر على إيقاف لإيقاف الفحص المباشر. إذا لزم الأمر ، اضبط معلمات الاكتساب بحيث تكون إشارة الفلورسنت المكتشفة أقل من مستويات التشبع مع الخلفية المحددة كما تم ضبطها عن طريق ضبط قيم الإزاحة. من علامة تبويب الرسم ، استخدم أداة الرسم bezier لرسم عائد استثمار صغير لترسيم منطقة تبييض الصور على الصورة التي تم الحصول عليها عن طريق المسح.

ثم قم بإجراء الحصول على الصور ، من خلال النقر على بدء التجربة. لإجراء تلطيخ مباشر بأصباغ الميتوكوندريا الفلورية ، قم بتخفيف مخزون البقع في وسط تشريح دافئ إلى تركيزات العمل النهائية. بعد إظهار التشريح والمضايقة في وقت سابق ، ضع المبايض في 200 ميكرولتر من محلول التلوين في بئر من طبق التشريح.

غطي الطبق بصندوق ملفوف بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء واحتضان الأنسجة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل المبايض الملطخة باستخدام ملقط لنقلها بعناية إلى ثلاثة آبار متتالية تحتوي على وسط بدون وصمة. للتلوين المشترك مع TMRE ، في صبغة الميتكوندريا الشاملة المتوافقة ، قم بتنفيذ التلوين باستخدام TMRE أولا ، ثم دون غسل الأنسجة ، انقل العينة على الفور إلى بقعة الميتوكوندريا الشاملة.

بعد غسل المبايض وتركيبها كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، لإجراء تصوير متحد البؤر على العينة ، حدد مربع التقسيم z لفتح علامة التبويب. أدر عجلة التركيز باتجاه الجزء السفلي من العينة أثناء مسحها ضوئيا مباشرة وانقر فوق المجموعة أولا لتحديد القسم z السفلي. ثم حرك عجلة التركيز البؤري في الاتجاه المعاكس لتحديد القسم العلوي.

قم بإجراء الحصول على الصور بالنقر فوق بدء التجربة. في حالة الفحص المجهري الحي ، يجب الحصول على البيانات في غضون 15 دقيقة من تركيب الأنسجة ، وإلا فقد تتأثر النتائج التجريبية بتغيرات في علم وظائف الأعضاء بسبب موت الأنسجة الذي يتبع. مباشرة بعد التشريح تحت غطاء الدخان ، ضع المبايض في 200 ميكرولتر من PFA بدرجة حرارة الغرفة الطازجة في بئر طبق تشريح زجاجي.

احتضان الأنسجة لمدة 15 دقيقة لإصلاحها. بعد غسل المبايض في PBS وفقا لبروتوكول النص ، بينما لا تزال في PBS ، قم بإثارة المبايض لإزالة غمد الألياف الواقية بعناية الذي قد يعيق وصول المستضد من الجسم المضاد. قم باختراق المبايض المزعجة عن طريق وضعها في أنبوب ميكروفيوز يحتوي على 500 ميكرولتر من 0.5 بالمائة من التريتان × 100 في PBS.

بعد ذلك ، ضع الأنبوب في صندوق مغطى واضبطه على الصخور عند 25 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة PBS / TX وفقا لبروتوكول النص ، وقم بحظر الأنسجة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من BSA المذاب في 0.5 بالمائة PBS / TX. احتضان العينات على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد إزالة محلول الحجب ، أضف الأجسام المضادة للدسيكلين E المضادة للكلعور والأجسام المضادة ل ATPB المضادة. احتضان الأنسجة على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، استخدم PBS-TX لغسل المبايض ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.

ثم أضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة و PBS-TX الطازج واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد غسل الأنسجة مرتين ، أضف السنانير إلى الغسيل الثالث. ثم باستخدام مليلتر واحد من المليلتر ، قم بإزالة المبايض الملطخة بالمناعة من أنبوب الصمامات الدقيقة إلى بئر جديد من طبق تشريح زجاجي يحتوي على 200 ميكرولتر من PBS.

أضف قطرة واحدة من وسط التثبيت القائم على الجلسرين إلى شريحة زجاجية وأضف المبايض الملطخة بالمناعة واحدة تلو الأخرى إلى وسط التثبيت. تحت مجهر التشريح ، أثناء الإمساك بالجزء المعتم من المبيض بالملقط ، استخدم إبرة إغاظة لنتف المبايض الشفافة برفق من غرف البيض الناضجة المعتمة. ثم قم بإزالة غرف البيض الناضجة من وسط التثبيت.

ضع غطاء زجاجي على الشريحة واضغط برفق لضمان انتشار وسط التثبيت بشكل موحد. جفف العينات بالهواء لمدة 15 دقيقة قبل استخدام طلاء الأظافر لإغلاق الحواف. أخيرا ، قم بإجراء الفحص المجهري متحد البؤر حسب الحاجة.

كما هو موضح هنا ، يؤدي الوجه الذي يستهدف إحدى غيوم الميتوكوندريا المرتبطة بالخلايا النرسية إلى فقدان أكثر من 50 في المائة من إشارة الفلورسنت من عائد الاستثمار الأزرق والأبيض المحيط بعائد الاستثمار الأحمر في غضون 200 ثانية بينما يتم تبييض عائد الاستثمار في اللون الأصفر بالحد الأدنى من التبييض. أظهر ذبابة الفاكهة المبايض انخفاضا في الإشارة مع عمق الأنسجة ، ومن المهم تمييز أقصى عمق للأنسجة التي يمكن من خلالها اكتشاف الفلوروفورات مثل TMRE و mitostain أثناء التصوير الحي. يظهر التحليل النوعي من التلوين المشترك مع TMRE وصمة عار الميتوكوندريا الإجمالية ، أن drisophilla germarium يظهر إمكانات أعلى للميتوكوندريا لكل وحدة كتلة في المرحلة 2B.

في هذا الشكل ، يوضح التحليل شبه النوعي الفرق في إمكانات الميتوكوندريا لكل وحدة كتلة بين AFC و MBC كما تم تحليلها من غرفة البيض في المرحلة 9. تكشف هذه الصور أن امتصاص الميتوزوكس يحدث في خلايا بصيلات دريسوفيلا الانقسامية وما بعد الانقسام. في هذه التجربة ، يحدد التلوين المناعي المشترك إشارة الديسيكلين المرتفعة المتداخلة مع إشارة ATPB للميتوكوندريا واستنساخ نول DRP1 السلبي GFP في Germarium وفي غرفة البيض في المرحلة 9.

يمكن تعديل الطرق الموصوفة واستخدامها لدراسة وظيفة بنية الميتوكوندريا في أنسجة دريسوفيلا الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح المبايض وصبغها وصورتها الثابتة والحية لدراسة بنية الميتوكونريا ووظيفتها.