بروتوكول تجريبي للكشف البكتيريا الزرقاء في العينات السائلة والصلبة مع الأجسام المضادة ميكروأري رقاقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وجود سلالات متعددة من البكتيريا الزرقاء في العينات السائلة والصلبة باستخدام المقايسة المناعية للمصفوفة الدقيقة الفلورية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجالات البيئية والمراقبة وإدارة المياه ، مثل وجود السموم المنتجة للبكتيريا المنتجة للسموم الأولية قبل أن تصبح الإزهار مرئية للعين المجردة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مراقبة سلالات متعددة من البكتيريا الزرقاء وعينات متعددة في وقت واحد في فترة ثلاث أو أربع ساعات ، سواء في الموقع أو في المختبر.

لذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتنوع البيولوجي. يمكن تطبيقه أيضا على مجالات أخرى ، مثل مراقبة المنشآت الزراعية أو اكتشاف الحياة في بيئات الإجهاد أو استكشاف الكواكب. بشكل عام ، لن يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة.

بسبب البساطة في معالجة العينة وسهولة تفسير النتائج. بعد إنتاج وتنقية الأجسام المضادة وفقا لبروتوكول النص ، أضف 100 ميكرولتر من DMSO إلى قارورة تجارية تحتوي على صبغة لوضع العلامات ، ملليغرام واحد من البروتين. بمجرد إذابة الصبغة ، قم بتسمية الأجسام المضادة المنقاة بإضافة ميكرولترين من الصبغة إلى 50 ميكرولتر من كل مستحضر للجسم المضاد.

حافظ على تفاعلات الملصقات في درجة الحرارة المحيطة تحت التحريك المستمر على منصة اهتزازية لمدة ساعة واحدة. بعد تنقية الأجسام المضادة المصنفة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتحميل كمية صغيرة في مقياس الطيف الضوئي وقم بقياس الامتصاص عند 280 و 650 نانومتر. احسب كفاءات وضع العلامات باتباع توصيات الموردين.

لعمل CYANOCHIP ، قم بإعداد 30 ميكرولترا من كل جسم مضاد منقى عن طريق خلط ملليغرام واحد لكل مليلتر من الجسم المضاد في مخزن مؤقت لطباعة البروتين 1X مع حجم 01٪ لكل حجم من Tween 20. قم بإعداد 30 ميكرولترا من حلول الطباعة التالية كعناصر تحكم. 1X مخزن مؤقت لطباعة البروتين مع 01٪ من الحجم لكل حجم من Tween 20.

كل بروتين مصل مناعي منقى بمقدار ملليغرام واحد لكل مليلتر في مخزن مؤقت لطباعة البروتين 1X مع 01٪ Tween 20 ومليلغرام واحد لكل مليلتر من BSA و 1X مخزن طباعة البروتين مع 01٪ Tween 20. أضف 30 ميكرولترا لكل بئر من حلول الطباعة المعدة إلى ألواح دقيقة عالية الجودة 384 جيدا. بعد إعداد روبوت الطباعة وركائز الشريحة وفقا لبروتوكول النص ، حدد جميع الأجسام المضادة وعناصر التحكم على الشرائح في نمط بقعة ثلاثي النسخ يبلغ قطرها حوالي 180 إلى 200 ميكرون.

لأخذ العينات في البيئة ، استخدم حقنة معقمة لجمع واحد إلى 100 مل من السوائل وتركيز الخلايا عن طريق تمرير العينة عبر مرشح بحجم المسام ثلاثة ميكرون. إذا لزم الأمر ، اجمع عينات صلبة من الصخور أو التربة واحتفظ بها في أنابيب معقمة. يمكن فحص العينات في مختبر ميداني صغير.

أضف ملليلترا واحدا من مخزن حضانة الاستخراج لاستعادة الكتلة الحيوية المجمعة في المرشح واستخدم موضعا لكشط المرشح في أنبوب سعة 15 ملليلترا. باستخدام معالج بالموجات فوق الصوتية المحمولة ، أو عن طريق الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، يقوم هذا الركام بتجميع العينة وتجانسها. بالإضافة إلى ذلك ، قم بوزن ما يصل إلى 0.5 جرام من العينة الصلبة في أنبوب منفصل سعة 10 مليلتر وأضف ما يصل إلى ملليلترين من المخزن المؤقت للاستخراج.

اغمر مسبار الصوتنة في الأنبوب والصوتنة باستخدام معالج بالموجات فوق الصوتية المحمولة أو جهاز الموجات فوق الصوتية الآخر. أثناء الاحتفاظ بالعينة على الجليد ، قم بإجراء خمس دورات على الأقل مدتها 30 ثانية عند 30 كيلو هرتز ، وتوقف لمدة 30 ثانية بين الصوتنة. لتحضير مستخلص الترشيح للمقايسة المناعية ، استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر مقترنة بحامل مرشح نايلون بحجم مسام من خمسة إلى 20 ميكرون لتصفية المحلول في أنبوب سعة 1.5 مليلتر لإزالة الرمل والطين والمواد الخشنة الأخرى.

مع توجيه بقع المصفوفة الدقيقة لأسفل ، ضع الشريحة على قطرة من 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول الحجب واحتضانها لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. باستخدام ملقط ذو رؤوس بلاستيكية ، وتجنب مناطق المصفوفات الدقيقة ، التقط الشريحة بعناية. اغمر الشريحة في محلول مانع جديد واحتضان الشريحة بتحريض خفيف لمدة 30 دقيقة.

لتجفيف الشريحة ، ضعها في جهاز طرد مركزي مكيف لشرائح المجهر وقم بتدويرها لفترة وجيزة. قم بإعداد الشريحة في كاسيت تهجين المصفوفات الدقيقة بثلاثة في ثمانية بئر باتباع تعليمات المزود. بدلا من ذلك ، بعد تعديل نمط طباعة الأجسام المضادة ، قم بإعداد شريط مخصص ، مثل الشريط الموضح هنا ، أو ببساطة استخدم شرائح الغلاف للإعداد.

بعد تجميع الشرائح والكاسيت، قم بتعبئة ماصة تصل إلى 50 ميكرولترا من كل عينة مستخلص أو تخفيفها في مخزن حضانة الاستخراج في كل بئر من الكاسيت. بدلا من ذلك ، قم بتحميل العينات في أجهزة حضانة أخرى أو ببساطة استخدم شرائح الغطاء. كعنصر تحكم فارغ ، يتم وضع الماصة 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت TBSTRR في بئرين منفصلين على الأقل من الكاسيت.

احتضان العينات في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة واخلطها عن طريق سحب العينة كل 15 دقيقة ، أو احتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة. لغسل المصفوفات الدقيقة ، ضع الدرج لأسفل واضغط عليه بعناية على ورق ماص نظيف. ثم اغسل الآبار بإضافة 150 ميكرولتر من مخزن حضانة الاستخراج إلى كل واحدة وقم بإزالة المخزن المؤقت عن طريق النقر على ورق ماص كما كان من قبل.

كرر الغسيل ثلاث مرات أخرى. أضف إلى كل بئر 50 ميكرولترا من خليط الأجسام المضادة الفلورية الذي يحتوي على 17 أجساما مضادا مضادا للبكتيريا الزرقاء. احتضان العينات في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة أو عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة.

لغسل المصفوفات الدقيقة ، ضع الكاسيت بحذر واضغط عليه برفق على ورق ماص نظيف. ثم أضف 150 ميكرولترا من مخزن حضانة الاستخراج قبل إزالته عن طريق النقر على منشفة ورقية. كرر الغسيل ثلاث مرات.

ثم قم بفك الكاسيت واغمر الشريحة في محلول 0.1X PBS لشطف سريع. جهاز الطرد المركزي بسرعة كما كان من قبل لتجفيف الشريحة. باستخدام ماسح ضوئي للفلورسنت، امسح الشريحة بحثا عن التألق عند أقصى ذروة انبعاث بحثا عن صبغة الفلورسنت الحمراء البعيدة.

التقط عدة صور للمصفوفات الدقيقة بمعلمات مسح ضوئي مختلفة عن طريق تغيير قيمة الكسب. أخيرا ، قم بتحميل الشبكة ، وحدد كمية البيانات ، ثم قم بمعالجتها وتحليلها وفقا لبروتوكول النص. تم استخدام المقايسة المناعية متعددة الإرسال CYANOCHIP الموضحة في هذا الفيديو لاختبار التحديد المتزامن لأنواع البكتيريا الزرقاء الأكثر صلة بالمياه العذبة كما هو مذكور في هذا الجدول.

تم تحليل عينات المياه التي تم جمعها على شاطئ خزان المياه العذبة باستخدام مقايسة المصفوفات الدقيقة. تتوافق التفاعلات المناعية الإيجابية الرئيسية مع الأجسام المضادة للبكتيريا الزرقاء العوالق أنواع microcystis وأنواع leptolyngbya القاعية. تم الحصول على إشارات فلورية أقل لأنواع العوالق nostocales aphanizomenon ، وأنواع anabaena ، و microcystis flos-aquae ، وأنواع rivularia القاعية.

تم التحقق من صحة المصفوفة الدقيقة أيضا عن طريق فحص حصيرة ميكروبية جافة في القطب الجنوبي لاختبار وجود علامات البكتيريا الزرقاء. تم إنتاج تفاعلات إيجابية في الأجسام المضادة للبكتيريا الزرقاء القاعية وأنواع anabaena وأنواع leptolyngbya. تم الكشف عن تفاعلات مناعية إيجابية إضافية مع الأجسام المضادة للبكتيريا الزرقاء العوالق ، مثل أنواع microcystis وأنواع aphanizomenon وأنواع العوالق rubescens.

أخيرا ، تم الحصول على هذه الإشارات من الأجسام المضادة لأنواع القاع الأخرى ، بما في ذلك أنواع توليبوثريكس وأنواع أنابينا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاث أو أربع ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، باستثناء إنتاج الأجسام المضادة والتسوية. من خلال الحضانة المتزامنة للعينة والأجسام المضادة الفلورية ، يمكن توفير ساعة واحدة.

أثناء محاولة هذه الإجراءات ، من المهم أن تتذكر أن يكون خليط الأجسام المضادة الفلورية جاهزا بجسمه المضاد في تخفيف العمل الأمثل. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الفحص المجهري البصري أو استخراج الحمض النووي وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المحدد ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل تركيز التربة أو لتأكيد نوع السلالة المكتشفة. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المراقبة البيئية لاستكشاف المسطحات المائية ، في عمليات الزراعة الثنائية ، إدارة المياه العذبة أو الدراسات البيئية الميكروبية ، بغض النظر عن نوع العينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الأجسام المضادة بالتألق ، ومعالجة المصفوفات الدقيقة للأجسام المضادة ، وإجراء المقايسة المناعية متعددة الإرسال وتحليل وتفسير نتائج المقايسة المناعية للمصفوفات الدقيقة. لا تنس أن العمل باستخدام الموجات فوق الصوتية يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء أجهزة حماية الأذن أو غيرها من تدابير العناية المحددة أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.