منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

تم نشر هذا البروتوكول في الأصل بواسطة الدكتور Gary Bunker وزملائه، وهم يتيحون زراعة الخلايا العصبية الحصينية الجنينية بكثافة منخفضة ونقاء عالٍ، وذلك عن طريق تعليق الخلايا العصبية فوق طبقة ترشيح دبقية. وتعد هذه النتيجة ميزة أساسية مقارنة بنتائجنا الأخرى المتعلقة بالحصين، لأنها تمكن الخلايا العصبية من النمو بكثافات منخفضة مع وجود عدد قليل من الخلايا الدبقية الملوثة. وبناءً على ذلك، فإن هذه النتيجة مثالية للتصوير عالي الدقة والتحليل الوظيفي المورفولوجي للخلايا العصبية الناضجة في المزارع الخلوية.

من شأن مرحلة ما بعد النضج في هذا البروتوكول أن تسرع من عملية التكيف مع الحياة الجديدة، نظرًا لوجود عدة حالات رئيسية خلال الإجراء يصعب وصفها، لذا فإن البروتوكول يوجهك خطوة بخطوة. يتكون هذا البروتوكول من ثلاث مجموعات مستقلة مطلوبة لاستنبات عصبونات أولية عالية الجودة. وتشمل هذه العمليات استنبات الخلايا الدبقية، وإنشاء وتغليف الشرائح الغطائية، وتحضير خلايا العصبونات الحصينية.

للبدء، يجب الحصول على أنسجة قشرية من جرذان في مرحلة مبكرة بعد الولادة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. وعلى الرغم من عدم عرض ذلك هنا بشكل مباشر، يُرجى ملاحظة أن خطوة التشريح الموضحة لاحقاً في هذا البروتوكول تكاد تكون متطابقة مع تلك المستخدمة في التشريح القشري. لهذا السبب، سيتم تسليط الضوء على الخطوات ذات الصلة أثناء إجراء تشريح الحصين الموضح لاحقاً في هذا الفيديو.

بدءاً من الخطوة السادسة من البروتوكول المكتوب، قم بإزالة HBSS من النسيج القشري الذي تم جمعه، ثم قم بتقطيع النسيج إلى أصغر قطع ممكنة باستخدام المقص. أضف كمية كافية من HBSS إلى النسيج المقطع لنقل قطع النسيج إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter، ثم أكمل الحجم الإجمالي إلى 12 milliliters بإضافة HBSS. أضف 1.5 milliliters لكل من trypsin بتركيز 2.5%، ومحلول DNA بتركيز 10 milligram per milliliter، ثم اقلب الأنبوب للمزج، بعد ذلك قم بحضن الخليط الناتج في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degree Celsius لمدة 12 دقيقة.

قم بسحق الأنسجة من 10 إلى 15 مرة باستخدام ماصة باستور زجاجية، ثم قم بتحضينها في الحمام المائي لمدة ثلاث دقائق أخرى. تأكد من ترسب أي قطع نسيجية في قاع الأنبوب، ثم قم بترشيح السائل الطافي إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على 5 milliliters من BGS. أضف 13.5 milliliters من HBSS، و 1.5 milliliters من 2.5&trypsin إلى الأنبوب الذي يحتوي على القطع المتبقية من الأنسجة غير المهضومة، واقلب الأنبوب للمزج، ثم قم بتحضينه في الحمام المائي لمدة 10 دقائق إضافية.

بعد التحضين، قم بسحق الأنسجة المتبقية من 10 إلى 15 مرة، ثم قم بتصفيتها في الأنبوب الذي يحتوي على الرشاحة الأولية. بعد ذلك، اشطف المرشح عن طريق تمرير 3 milliliters إضافية من BGS عبره. في هذه المرحلة، يمكن تقسيم الرشاحة إلى عدة أنابيب لتسهيل عمليتي الموازنة وإعادة تعليق كريات الخلايا.

قم بطرد المعلقات مركزياً لمدة ست دقائق بسرعة 130 G. بعد عملية الطرد المركزي، لاحظ أن الجزء السفلي من الراسب يبدو مائلاً للاحمرار قليلاً، وذلك بسبب وجود مكونات الدم. تخلص من السوائل الطافية، ثم أضف 1 milliliter من الوسط الدبقي إلى كل أنبوب، مع الحرص على عدم تعكير الراسب. انقل أجزاء كل راسب التي لا تظهر بهذا المظهر المائل للاحمرار إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter.

أضف ما يصل إلى 2 milliliters من الوسط الدبقي لكل جرو لإعادة تعليق الأنسجة المجمعة، وانقل كل 2 milliliters من المعلق إلى 18 milliliters من الوسط الدبقي المسخن مسبقاً في قارورة زراعة بمساحة 75 centimeter squared. حضّن القارورة في حاضنة عند 37 degrees Celsius و5%CO2. وفي اليوم التالي لزراعة الخلايا، استبدل الوسط في كل قارورة بوسط دبقي جديد.

لاحظ أنه في هذا الوقت، ستكون المزرعة مزيجاً من الخلايا النجمية وأنواع أخرى من الخلايا غير المستهدفة. لإزالة أنواع الخلايا غير النجمية، يجب رج الدوارق بقوة بعد حوالي أربعة أيام من الاستزراع. للقيام بذلك، اشطف الدوارق بمحلول HBSS، ثم أضف 10 milliliters من محلول HBSS الطازج إلى كل دورق ورج كل منها بقوة من خمس إلى 10 مرات.

قم بشفط محلول HBSS، واغسل مرتين إضافيتين باستخدام HBSS. ثم أضف 20 milliliters من الوسط الغروي، وأعد الدوارق إلى الحاضنة كما سبق. لاحظ أنه على الرغم من قوة هذه العملية، فإن الخلايا النجمية المطلوبة للزرع ستظل ملتصقة بقوة بسطح الدورق.

للحفاظ على مستنبتات الخلايا النجمية، يتم تغيير الوسط إلى وسط دبقي طازج مرتين أسبوعياً حتى تصل الخلايا إلى حالة التلاقي. وبمجرد وصولها إلى حالة التلاقي، يمكن تجميد الخلايا لاستخدامها مستقبلاً كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. يجب زراعة الخلايا الدبقية في أطباق قبل 14 يوماً على الأقل من بدء استنبات الخلايا العصبية وفقاً لما ورد في البروتوكول المكتوب.

اغمر شرائح التغطية في حمض النيتريك المركز وعرضها للموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. توخَّ الحذر، حيث إن حمض النيتريك المركز مادة كاوية للغاية. لاحظ أيضاً أن بعض المختبرات تفضل نقع شرائح التغطية في حمض النيتريك طوال الليل باستخدام رفوف صبغ سيراميكية.

تخلص بعناية من حمض النتريك في خزانة استرداد الغازات الكيميائية وفقاً للإرشادات المؤسسية، ثم اشطف شرائح التغطية ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. اغمر شرائح التغطية في الماء، وعرضها للموجات فوق الصوتية مرة أخرى لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الماء واشطف شرائح التغطية ثلاث مرات أخرى.

اغمر شرائح التغطية في 50 milliliters من الماء، ثم قم بتعقيمها باستخدام الموصدة (autoclave). وفي غطاء تدفق صفائحي معقم، تخلص من الماء وأضف من 20 إلى 30 milliliters من الإيثانول للشطف. أضف 20 إلى 30 milliliters أخرى من الإيثانول، ثم انقل شرائح التغطية والإيثانول إلى طبق بتري بقطر 100 millimeter.

باستخدام ملاقط غير مدببة، انقل شرائح التلوين إلى أطباق بتري سعة 60 milliliter، بواقع أربع إلى خمس شرائح لكل طبق، ثم اتركها لتجف في الهواء عن طريق إسناد الشرائح الغطائية على حافة الطبق. وبمجرد تبخر الإيثانول، أعد الشرائح الغطائية إلى الوضع الأفقي. صهر 10 grams من البارافين في زجاجة مقاومة للحرارة، وحافظ على درجة حرارتها عند حوالي 150 إلى 200 degrees Celsius.

قد يتطلب الوصول إلى درجة الحرارة المثالية بعض الضبط، حيث يمكن أن تؤدي درجات الحرارة غير الصحيحة إلى صعوبة في إنتاج أرجل بارافين ذات حجم مناسب. اغمسي ماصة باستور في البارافين، ثم المسي بها بسرعة ثلاث نقاط بالقرب من حافة كل شريحة غطاء. ستتصلب قطرات البارافين لتشكل حبيبات يبلغ ارتفاعها تقريباً 3 إلى 5 millimeters، وقطرها من 1 إلى 2 millimeters، وستعمل على توفير مساحة بين العصبونات الموجودة على شريحة الغطاء والطبقة الأحادية الدبقية الموجودة أدناها.

أحضر الأطباق التي تحتوي على شرائح غطاء تم تحضيرها مسبقاً مع قواعد من البارافين. أضف 200 µL من poly-l-lysine ومحلول البورات المنظم إلى سطح كل شريحة غطاء، واترك المحلول على شرائح الغطاء طوال الليل، مغطاة في درجة حرارة الغرفة. يجب أن يكون السطح المراد طلاؤه هو نفس السطح الذي تقع عليه حبيبات البارافين.

إذا تم التنظيف بشكل صحيح، يجب أن ينتشر poly-l-lysine بسهولة ليغطي سطح شريحة الغطاء. في صباح اليوم التالي، اغسل شرائح الغطاء مرتين عن طريق نقعها في ماء معقم لمدة ساعتين في كل مرة. بعد الغسلة الأخيرة، استبدل الماء بـ 4 milliliters من وسط الزراعة لكل طبق.

يرجى ملاحظة أنه من المهم عدم السماح لسطح الشرائح الغطائية بالجفاف بعد طلائها بالبولي-ل-لايسين (poly-l-lysine). ضع أطباق الشرائح الغطائية في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C. يجب تحضين الشرائح الغطائية المطلية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل البدء في زراعة الخلايا العصبية.

احصل على جرذة حامل في اليوم الجنيني 18 أو 19، وقم بقتلها بطريقة معتمدة. رُش الجزء السفلي من الجرذة بكحول إيثانول 70%، ثم قم بعمل شق في خط المنتصف من منطقة العانة وصولاً إلى نهاية التجويف البطني. ولتجنب التلوث، احرص على القطع عبر الجلد فقط في هذه الخطوة.

قم بتعقيم أدوات التشريح باستخدام 70% ethanol، ثم اقطع جدار البطن للكشف عن الرحم. أزل قرني الرحم وضعهما في طبق معقم. وفي غطاء تدفق صفائحي معقم، قم بإزالة الأغشية الرحمية المحيطة بالأجنة، ثم افصل الرؤوس وضعها في طبق Petri بحجم 100 millimeter يحتوي على 20 milliliters من HBSS.

قم بتشريح الأدمغة، وضعها فوراً في طبق بتري بقطر 60 مليمتر يحتوي على 2 مليلتر من HBSS على الثلج. اجمع من دماغين إلى ثلاثة أدمغة فقط في كل طبق لتوفير مساحة كافية للخطوة التالية. وباستخدام مجهر تشريحي، قم بإزالة السحايا من الخط الناصف لنصفي الكرة المخية.

بعد ذلك، قم بتشريح واستئصال الحصين. لاحظ أنه يمكن تمييز الحصين كبنية هلالية الشكل في السطح الإنسي للنصف الكروي القشري، ويسهل إزالته لكونه محاطاً جانبياً ببطين. وبمجرد تحريره، ضع الحصين في طبق بيتري بقطر 60 millimeter يحتوي على 4.5 milliliters من HBSS واحفظه على الثلج.

لاحظ أن الخطوات المتبعة حتى هذه النقطة تنطبق أيضاً على تشريح القشرة المخية، باستثناء الاحتفاظ بالقشور بدلاً من الحصينات. بالنسبة لتشريح القشرة المخية، ستكون الخطوة التالية هي فصل القشرة عن بقية الدماغ، كما هو موضح هنا، ثم جمع القشور ومحلول HBSS كما تم توضيحه سابقاً. وبمجرد جمع كل أنسجة الحصين في محلول HBSS، يتم نقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

أضف 5 milliliters من trypsin بتركيز 2.5%، ثم قم بتحضينها عند 37 degrees Celsius لمدة 10 minutes. أزل محلول trypsin برفق باستخدام ماصة باستور، مع ترك نسيج الحصين دون تحريك في قاع الأنبوب. اغسل النسيج مرتين عن طريق إضافة 5 milliliters من HBSS برفق، والتحضين عند 37 degrees Celsius لمدة five minutes، ثم إزالته مرة أخرى باستخدام ماصة باستور، مع الحرص على عدم تحريك النسيج الموجود في القاع.

أثناء انتظار خطوة الحضن الموضحة سابقاً، قم بتجهيز نوعين من الماصات المصقولة باللهب لتفكيك الأنسجة. وللقيام بذلك، عرض طرف ماصة باستير الزجاجية لفترة وجيزة للهب، ثم افحص طرف الماصة. بالنسبة للنوع الأول، كرر هذه الخطوة حتى يتم تنعيم حواف طرف الماصة، مع بقاء القطر دون تغيير.

بالنسبة للمرة الثانية، كرر العملية حتى يتم تنعيم الحواف وتقليل قطر الطرف إلى النصف تقريباً. من المهم التدرب لإيجاد القطر المثالي لضمان تفكك النسيج لإنتاج خلايا مفردة دون إتلاف هذه الخلايا أثناء العملية. بعد الغسلة الثانية، اجعل الحجم الإجمالي 5 milliliters عن طريق إضافة حجم كافٍ من HBSS إلى النسيج.

قم بسحق نسيج الحصين أولاً من خلال تمريره حوالي 10 مرات عبر ماصة عادية ذات حواف ملساء، ثم مرره من 5 إلى 10 مرات إضافية عبر ماصة ذات قطر طرفي مخفض. الهدف هنا هو الحصول على محلول متجانس من الخلايا خالٍ من تكتلات النسيج، أو يحتوي على تكتلات قليلة جداً. حدد كثافة الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer).

تبلغ الإنتاجية النموذجية حوالي 800,000 إلى مليون خلية لكل جرو. انقُل حجماً كافياً من معلق الخلايا إلى أطباق تحتوي على شرائح غطاء مطلية بـ poly-l-lysine في 4 milliliters من وسط الزراعة، للحصول على كثافة زراعة تتراوح بين 100,000 إلى 500,000 خلية لكل طبق بقطر 60 millimeter، وذلك اعتماداً على التجربة المقصودة. ضع الأطباق في حاضنة بدرجة حرارة 37 degree Celsius و5%CO2.

بعد مرور ثلاث إلى أربع ساعات، انقل شرائح الغطاء التي تلتصق بها الخلايا العصبية إلى أطباق تحتوي على خلايا دبقية ووسط NBG. يجب تنفيذ هذه الخطوة بحيث يكون الجانب الذي زُرعت عليه الخلايا العصبية مواجهاً للأسفل باتجاه طبقة الخلايا الدبقية. أضف ما مجموعه أربع أو خمس شرائح غطاء لكل طبق خلايا دبقية.

بعد يومين أو ثلاثة أيام من عملية الزرع، أضف محلول aerocele ليصل إلى تركيز نهائي قدره 5 µM لكل طبق لإيقاف نمو الخلايا الدبقية. قم بتغذية الخلايا مرة واحدة أسبوعياً عن طريق استبدال 2 mL من الوسط القديم بـ 2.5 mL من الوسط الجديد عند كل تغذية. والهدف من إضافة كمية زائدة من الوسط هو التعويض عن التبخر بمرور الوقت.

ويتم تغيير جزء فقط من الوسط لضمان تكييف الوسط بشكل متسق بواسطة الخلايا الدبقية. وعادة ما تظل هذه المزارع سليمة لمدة شهر واحد على الأقل. تم تثبيت العصبونات باستخدام 4%paraformaldehyde، ثم تم تحضينها في أجسام مضادة أولية للتصوير الفلوري.

كما يتضح من صبغات المناعية لـ Tau وMAP2، تطور هذه الخلايا العصبية تفرعات واسعة مع محاور استطالية واستطالات شجيرية مكتملة النمو. كما تطور الخلايا العصبية الناضجة شوكات مشبكية، والتي تم تحديدها من خلال التموضع الانتقائي لبروتين Drebrin One، وتكون هذه الشوكات متقابلة عن كثب مع تخصصات ما قبل المشبك كما تم تحديدها بواسطة الصبغة المناعية لـ synapse in one. وتعد هذه الخلايا العصبية الأولية مناسبة تماماً للدراسات الوظيفية والبنيوية للخلايا العصبية والمشابك، بما في ذلك دراسات نقل الإشارة، والقطبية العصبية، والنقل تحت الخلوي، وتطور المشابك ومرونتها، من بين دراسات أخرى.

من شأن هذا الفيديو أن يساعد في فهم والتنفيذ الدقيق لعدة خطوات أساسية في هذا البروتوكول. ومن شأن الالتزام السليم بالطريقة الموضحة أن يؤدي إلى استنبات مستنبتات عصبية صحية ذات كثافة عالية مع تشجر واسع ومشابك عصبية متطورة جيداً من الناحيتين المورفولوجية والوظيفية.