النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

الهدف العام لهذه المنهجية هو تحديد الفسفرة المتعددة لبروتين مضطرب جوهريا عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي باستخدام بروتين تاو كدراسة حالة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في التنظيم الجزيئي المتعلق بالمرض مثل تأثير الفسفرة على تفاعل البروتين مع شريكه الجزيئي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تحديد الفسفرة الخاصة بالموقع في بروتين مضطرب وربطه بالتغيرات الهيكلية والوظيفية.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للوظيفة. يمكن تطبيقه أيضا على بروتينات أخرى مثل البقايا المضطربة لبروتين الحمض النووي من فيروس aPtc تمتد تطبيقات هذه التقنية نحو العلاج عن طريق تطوير البروتين ومثبطات تفاعل البروتين. سيتم عرض هذه الطريقة من قبل كليمنت دانيس ، وكليمنت ديسبريس ، ولويزا بيسا ، وحميدة مرزوقي ، طلاب الدكتوراه من مجموعتنا.

للبدء ، امزج 50 ميكرولترا من خلايا BL21 المختصة برفق مع 100 نانوجرام من الحمض النووي البلازميد ، مما يشكل 10 إلى 15 مليون مستعمرة لكل ميكروغرام من الحمض النووي للبلازما في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 ملليلتر. بعد وضع خليط الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة ، صدمه بالحرارة لمدة 10 ثوان عند 42 درجة مئوية. ثم ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة خمس دقائق قبل إضافة ملليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة لوريا بيرتاني أو رطل متوسط.

احتضان المعلق البكتيري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت التحريك اللطيف. باستخدام موزعة ، انشر 100 ميكرولتر من معلق الخلية بالتساوي على صفيحة أجار من وسط LB يحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من المضادات الحيوية الأمبيسلين. احتضن لوحة الاختيار لمدة 15 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإذابة 300 ملليغرام من النيتروجين 15 والكربون 13 المخصب ، وجرام واحد من النيتروجين 15 كلوريد الأمونيوم وجرامين من الكربون 13 المسمى الجلوكوز في 10 ملليلتر من وسط M9. قم بتعقيم محلول النظائر مباشرة في وسط M9 باستخدام مرشح 0.2 ميكرون. باستخدام ماصة باستور ، مستعمرة واحدة من البلازما المؤتلفة ، تم تحويل البكتيريا من لوحة الاختيار في 20 مل من وسط LB ، مع استكمالها ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين.

احتضان الوسط الملقح عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات تقريبا. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر أو OD600 باستخدام مليلتر واحد من تخفيف عشرة أضعاف للثقافة البكتيرية في كوفيت مطياف بلاستيكي. بعد ذلك ، أضف 20 مل من ثقافة LB المشبعة إلى لتر واحد من وسط نمو M9 المكمل بالأمبيسلين في قارورة ثقافة زجاجية محيرة سعة لترين من Erlenmeyer.

ضع قارورة الاستزراع في حاضنة قابلة للبرمجة مضبوطة على 10 درجات مئوية و 50 دورة في الدقيقة. قم ببرمجة الحاضنة للتبديل إلى 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية في الصباح الباكر من اليوم التالي. قم بقياس OD600 على مليلتر واحد من المزرعة البكتيرية في كوفيت مطياف بلاستيكي.

أضف 400 ميكرولتر من محلول مخزون IPTG المولي عندما يصل OD600 إلى قيمة حوالي 1.0 للحث على التعبير عن بروتين تاو المؤتلف. بعد احتضان الخلايا البكتيرية عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات إضافية ، اجمعها عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 مرة جم لمدة 20 دقيقة. قم بإذابة حبيبات الخلية البكتيرية وأعد تعليقها جيدا في 45 مل من المخزن المؤقت للتبادل الكاتيوني A ، المكملة حديثا بكوكتيل مثبط البروتياز 1x DNasel 1.

قم بتعطيل الخلايا البكتيرية باستخدام الخالط عالي الضغط عند 20،000 رطل لكل بوصة مربعة ، من ثلاثة إلى أربعة تمريرات ضرورية لتعطيل الخلايا بشكل كاف. الطرد المركزي للخلايا المعطلة عند 20 ، 000 مرة جم لمدة 40 دقيقة لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. قم بتسخين مستخلص الخلايا البكتيرية لمدة 15 دقيقة عند 75 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.

سيتم ملاحظة راسب أبيض بعد بضع دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمستخلص الساخن عند 15 ، 000 مرة جم لمدة 20 دقيقة وحافظ على المادة الطافية التي تحتوي على بروتين تاو مستقر في الحرارة. بعد ذلك ، قم بإجراء كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني على راتنج CEX قوي معبأ كعمود سرير سعة 5 ملليلتر باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل بروتيني سريع.

اضبط معدل التدفق على 2.5 ملليلتر في الدقيقة وقم بموازنة العمود في المخزن المؤقت CEX A. بعد ذلك ، قم بتحميل مستخلص تاو الساخن من 60 إلى 70 مليلتر باستخدام مضخة عينة ، واجمع التدفق للتحليل للتحقق من أن بروتين تاو يرتبط بالراتنج بكفاءة. اغسل الراتنج باستخدام المخزن المؤقت CEX A حتى يعود الامتصاص عند 280 نانومتر إلى القيمة الأساسية.

قم ببرمجة FPLC بتدرج يصل إلى 25٪ CEX B في 10 أحجام أعمدة للوصول إلى 250 مللي مولار من كلوريد الصوديوم. اتبع ذلك مع 50٪ CEX B buffer في خمسة أحجام أعمدة للوصول إلى 500 مللي مولار من كلوريد الصوديوم. أخيرا ، قم بزيادة التدرج إلى 100٪ CEX B المخزن المؤقت في مجلدين ليصل إلى مولي واحد من كلوريد الصوديوم.

اجمع 1.5 ملليلتر من الكسور أثناء خطوات الشطف. بعد ذلك ، قم بإجراء تبادل مخزن مؤقت على تاو يحتوي على كسور مجمعة. قم بموازنة عمود تحلية المياه بسرير معبأ براتنج G25 سعة 53 مليلتر في عازلة بيكربونات الأمونيوم سعة 15 مليمولار باستخدام نظام FPLC.

اضبط معدل التدفق على خمسة ملليلتر في الدقيقة وحقن عينة تاو على العمود عبر حلقة حقن خمسة ملليلتر. اجمع الكسور المقابلة لذروة الامتصاص عند 280 نانومتر. قم بتجميع جميع كسور تاو قبل تخصيص العينة في الأنابيب.

اختر هذه الأنابيب بحيث يكون حجم المحلول صغيرا مقارنة بحجم الأنبوب. بعد ذلك ، قم بعمل ثقوب في أغطية الأنبوب باستخدام إبرة قبل تجميد عينات تاو عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتجميد لاحقا. قم بإذابة أربعة ملليغرامات من النيتروجين المجفف بالتجميد 15 والكربون 13 المخصب بفسفرة تاو في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي.

أضف خمسة بالمائة من أكسيد الديوتيريوم لقفل مجال مطياف الرنين المغناطيسي النووي ومليمولار TMSP كممرجع إشارة داخلي للرنين المغناطيسي النووي. أضف أيضا 10 ميكرولترات من محلول مخزون 40 EK من كوكتيل كامل مثبط للبروتياز. انقل العينة في أنبوب بالرنين المغناطيسي النووي سعة خمسة ملليلتر باستخدام حقنة إلكترونية بإبرة طويلة أو باستخدام ماصة باستور.

أغلق أنبوب الرنين المغناطيسي النووي باستخدام المكبس. قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة بين المكبس والسائل عن طريق تحريك المكبس. ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في دوار.

استخدم المقياس المناسب لضبط موضعه الرأسي في الدوار بحيث يكون معظم محلول العينة داخل ملف الرنين المغناطيسي النووي. بعد ذلك ، ابدأ تدفق الهواء في جهاز الرنين المغناطيسي النووي بالنقر فوق الرفع في نافذة نظام التحكم في المغناطيس. ضع الدوار بحذر مع الأنبوب في تدفق الهواء في الجزء العلوي من تجويف المغناطيس.

ثم أوقف تدفق الهواء واترك الأنبوب ينزل في مكانه داخل رأس المسبار داخل المغناطيس. بعد السماح للعينة بالتوازن إلى 25 درجة مئوية ، اكتب ATMM في سطر الأوامر لإجراء ضبط شبه تلقائي ومطابقة رأس المسبار لتحسين نقل الطاقة. ثم انقر فوق قفل في نافذة نظام التحكم في المغناطيس لتشغيل قفل تردد المجال لمقياس الطيف.

ابدأ إجراء التقطيع لتحسين تجانس المجال المغناطيسي في موضع العينة عن طريق كتابة واجهة المستخدم الرسومية TopShim أولا في سطر الأوامر لفتح نافذة الرقائق. ثم انقر فوق ابدأ في نافذة الرقائق. تحقق من الانحراف المعياري B0 المتبقي للتحقق من أن الحشوات هي الأمثل.

بعد ذلك ، قم بمعايرة المعلمة P1 ، وهي طول نبضة تردد بروتون الراديوي بالميكروثانية. هذه المعلمة ضرورية للحصول على دوران 90 درجة لمغنطة دوران البروتون. استهدف النبضة بزاوية 360 درجة باستخدام طيف أحادي البعد من بروتونات الماء.

اضبط إزاحة التردد عن طريق ضبط المعلمة O1 على تردد ماء البروتون في الطيف أحادي البعد. أخيرا ، ابدأ في الحصول على طيف البروتون أحادي البعد عن طريق كتابة ZG في سطر الأوامر. تظهر النتيجة التمثيلية لتنقية تاو المؤتلف ذروة امتصاص رئيسية عند 280 نانومتر لوحظت أثناء تدرج الشطف.

تتوافق هذه الذروة مع بروتين تاو المنقى كما هو موضح في هلام الأكريلاميد فوق الكروماتوجرام. يوضح الكروماتوجرام لتحلية تاو المنقى المؤتلف أن ذروة الامتصاص عند 280 نانومتر وذروة الموصلية مفصولة جيدا مما يضمن أن تحلية البروتين فعالة لخطوة التجميد بالتجميد. يؤكد طيف الرنين المغناطيسي النووي أحادي البعد للنيتروجين المؤتلف 15 تاو عند 900 ميغا هرتز أنه يمكن اكتشاف إشارة الرنين المغناطيسي النووي من عينة البروتين.

تشير نسبة الإشارة إلى الضوضاء الجيدة إلى أن معلمات الاستحواذ الأساسية قد تم ضبطها بشكل صحيح. يظهر الطيف ثنائي الأبعاد للبروتين الفسفوري دقة جيدة ، والرنين ضيق ومنفصل جيدا. تتوافق الرنين في منطقة الطيف المعبأة باللون الأحمر مع المخلفات الفسفرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إنتاج بروتين مؤتلف مع وضع علامات سهلة الاختيار ، لتنقية هذا البروتين وإعداد المعلمة الأساسية للحصول على بيانات الطيف. بمجرد إتقانه ، يمكن إجراء هذا البروتوكول في غضون أسبوعين إذا تم تنظيمه بشكل صحيح. لا تنس أن التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي يستخدم مغناطيسات قوية جدا يجب عدم الاقتراب منها بأجسام معدنية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن هذه البروتينات الأخرى حساسة لتحلل البروتياز ويجب اتخاذ عدد من الاحتياطات لتجنب تدهور العينة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة للتحقيق في المجاميع الشبيهة بالأميلويد التي غالبا ما تتكون من البروتينات المضطربة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الكيميائية لاستكشاف المركبات النشطة ذات الإمكانات السيراباتية في أنظمة النماذج المختبرية.