تصميم تجريبي ليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل: دروس من تحليل التنمية الذرة ورقة

الهدف العام لهذه الطريقة هو تحديد تراكم النسخ في خلايا أو مجالات خلوية معينة بحيث يمكن إجراء مقارنات بين مجالات مختلفة أو بين المجالات المكافئة في عينات النوع الطافرة والبرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي مثل كيفية تحديد مجالات الأعضاء أو كيف تؤثر الطفرات المحددة على التعبير الجيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن قياس تراكم النسخ في مجالات دقيقة ومحددة بدقة وصغيرة جدا بحيث لا يمكن تشريحها يدويا.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بزراعة مسطحات شتلات الذرة في ظل ظروف قياسية حتى عمر أسبوعين. لتشريح قمم البراعم للأقسام الجانبية ، قم أولا باستئصال الشتلات أسفل خط التربة مباشرة. ثم استخدم شفرة حلاقة لإزالة شرائح رفيعة من قاعدة الساق حتى يظهر شكل بيضاوي من الهدوء محاط بورقة أو ورقتين ناضجتين.

قم بعمل قطع آخر حوالي 10 ملليمترات فوق القاعدة. يحتوي هذا الجزء الذي يبلغ طوله 10 ملم على النسيج الإنشائي القمي في الأوراق الصغيرة. اقلب الجزء الذي يبلغ طوله 10 ملم بحيث تكون القاعدة متجهة لأعلى.

قم بعمل قطعتين موازيين للمحور الجانبي للحصول على شريحة من الأنسجة بسمك اثنين إلى ثلاثة ملليمترات. تخلص من الجزأين الخارجيين واحتفظ بالشريحة المركزية للتثبيت والتضمين. اغمر شريحة الأنسجة في ما يقرب من 10 ملليلتر من المزارعين في قارورة زجاجية على الثلج.

جميع العينات ، قم بتطبيق الفراغ لإزالة فقاعات الهواء والمساعدة في اختراق التثبيت. امسك بالمكنسة الكهربائية لمدة 10 دقائق ، ثم حرر المكنسة الكهربائية ببطء. استبدل المثبت ، واحتضنه عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع رج لطيف.

في اليوم التالي ، استمر في معالجة الأنسجة للتضمين كما هو موضح في بروتوكول النص. لصب كتل البارافين ، ضع قوالب التضمين على صفيحة ساخنة لمحطة تضمين الأنسجة ، واستخدم الملقط لنقل عينات الأنسجة إلى قوالب التضمين بحيث يكون السطح المقطوع متجها لأسفل. ضع حلقة التضمين في الجزء العلوي من القالب.

قم بتعبئة كل قالب بالبارافين المذاب. انقل القوالب إلى طبق بارد حتى يتجمد البارافين. قم بتخزين كتل البارافين في وعاء محكم الغلق مع هلام السيليكا عند أربع درجات مئوية.

يتم قطع الأقسام من كتل البارافين على ميكروتوم باتباع الإجراءات القياسية ، ويتم تحديد الأقسام المتوسطة التي تتضمن النسيج الإنشائي القمي للنبتة للتركيب. لتركيب الأقسام على الشرائح ، ضع الشرائح الخالية من RNase أو المخبوزة على جهاز تسخين منزلق 42 درجة مئوية. ضع عدة قطرات من محلول الإيثانول بنسبة 50٪ لتغطية كل شريحة.

ضع الأقسام برفق على الشريحة ، وقم بتعويم الأقسام على محلول الإيثانول حتى تتوسع. بعد ذلك ، قم بإمالة الشريحة وإزالة محلول الإيثانول الزائد عن طريق الشفط باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها. استخدم مناديل خالية من النسالة للتخلص من أي محلول إيثانول إضافي.

جفف الشرائح على حرارة 42 درجة مئوية لعدة ساعات أو طوال الليل. عندما تجف الشرائح ، قم بتخزينها في وعاء محكم الغلق مع هلام السيليكا عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة الشرائح في يوم التشريح المجهري.

قم بإعداد ثلاث برطمانات زجاجية من كوبلين ، وبرطمانتان تحتوي على حوالي 50 مل من الزيلين بنسبة 100٪ وجرة واحدة تحتوي على حوالي 50 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. اغمر الشرائح في الزيلين لمدة دقيقتين ، والزيلين اثنين لمدة دقيقتين ، و 100٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة. صفي الشرائح على مناديل خالية من النسالة وجففيها بالهواء في درجة حرارة الغرفة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتأمين الشرائح على مسرح مجهر التشريح المجهري بالليزر. أحد العوامل الحاسمة في نجاح التشريح الدقيق بالليزر في تجارب RNasic هو استخدام العلامات المورفولوجية والجزيئية لتحديد مجالات دقيقة للتشريح المجهري. افحص الشرائح باستخدام هدف 5X وحدد الأقسام الخمسة الأكثر متوسطا في كل شريحة باستخدام قمة النسيج الإنشائي القمي كنقطة مرجعية مركزية.

بعد ذلك ، استخدم إما هدفا 10X أو 20X لتحديد موضع السبق على البلاستوكرون المكون من سبع أوراق لكل قسم. سيكون الرباط مرئيا على شكل نتوء بارز من السطح المحوري للورقة البدائية. استخدم أداة الرسم الخاصة ببرنامج التشريح الدقيق بالليزر لتحديد هذا الموضع.

حدد أيقونة الرسم اليدوي ، وحرك المؤشر إلى الموضع المناسب ، وانقر فوق الماوس واسحبه للرسم. تتمثل الخطوة التالية في استخدام المسطرة وأداة الرسم المستطيلة لقياس مستطيلات بارتفاع 100 ميكرومتر متمركزة على ريجول من كل قسم كعينات من الليجول. لاستخدام أداة المسطرة، حدد أيقونة المسطرة، وحرك المؤشر إلى أحد طرفي المنطقة المراد قياسها، ثم انقر واسحب لقياس المنطقة.

سيظهر طول المسطرة على الشاشة. استخدم أداة المسطرة لقياس مقطع 100 ميكرومتر متمركز على ريجول. لرسم مستطيل، حدد أداة رسم الخط المستقيم وارسم أربعة خطوط مستقيمة.

بنفس الطريقة ، قم بقياس مستطيلات 100 ميكرومتر موضوعة على ارتفاع 50 ميكرومتر فوق وأسفل مستطيل اللجولة. ستكون هذه عينات الشفرة والغمد. قم بتشريح المستطيلات المقاسة باستخدام وظيفة القطع بالليزر لقطع قسم الأنسجة على طول الخطوط العريضة للمجال المحدد ، ووظيفة المنجنيق لدفع مستطيل الأنسجة من الشريحة إلى غطاء الأنبوب.

اجمع عينات الرباط والشفرة والغمد في أنابيب منفصلة. استخدم نفس الإجراء لتشريح عينات البشرة المحورية للشفرة والليجول والغمد من البلاستوكرون ذات الأوراق السبع الورق. أخيرا ، قم بتطبيق المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي على الأنسجة المجهرية واستمر في استخراج الحمض النووي الريبي ، وتضخيم الحمض النووي الريبي ، وبناء المكتبة ، والتسلسل ، وتحليل المعلوماتية الحيوية كما هو موضح في المخطوطة.

عندما تم تحليل تراكم النسخة وجميع طبقات الخلايا في مناطق الشفرة والليجول والغمد ، تم العثور على 2،359 جينا معبر عنه تفاضليا. في مناطق شفرة البشرة المحورية ، والليجول ، والغمد ، تم العثور على 3،128 جينا معبر عنه تفاضليا. أعطى التشريح الدقيق بالليزر ، و RLM ، وتسلسل الحمض النووي الريبي ، وتحليلات التهجين في الموقع نتائج متسقة كما هو موضح في هذه الجينات التمثيلية.

توضح الرسوم الكاريكاتورية الموجودة على اليسار LM لجميع طبقات الخلايا ، وتوضح الرسوم الكاريكاتورية الموجودة على اليمين LM للبشرة المحورية فقط. تشير رؤوس الأسهم في الصور إلى الليجولات الناشئة. كان تراكم النسخة الواحدة أعلى بكثير في السباط في كل من طبقات الخلايا و LM للبشرة ، وقد تم تنظيم غمد ضيق بشكل كبير في منطقة السباط في كل من طبقات الخلية LM والبشرة المحورية LM ، ويتراكم على وجه التحديد في طرف السباط الناشئ.

لجين غير معروف وظيفة أعلى في متوسط إعادة العد في LM للبشرة من جميع الطبقات LM ، ويتراكم هذا النسخة بقوة أكبر في خلايا البشرة. لم يتم التعبير عن الجين الرابع ، Zm PIN1a بشكل تفاضلي بشكل كبير في تحليل جميع طبقات الخلايا ولكن تم تنظيمه بشكل كبير في السبق في تحليل البشرة فقط. قد يكون تعبيره العالي في أنسجة الأوعية الدموية قد أربك الاختلافات في تراكم النسخ في البشرة عند جمع جميع طبقات الخلايا.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن اختيار المجالات الخلوية للتشريح الدقيق والمقارنة ، ودقة التشريح الدقيق أمران حاسمان لنجاح التجارب.