اختبار القدرة الأوعية الدموية الغازية من خلايا السرطان في الزرد (

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم السلوك الخبيث والغازي للخلايا السرطانية في نموذج جنين الزرد. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد ما إذا كان بإمكان الخلايا السرطانية الغزو من نظام الدورة الدموية الوظيفي ، وبالتالي نمذجة خطوة رئيسية في الشلال النقيلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نموذج جنين الزرد يوفر هذا التقييم ووقت استجابة أقصر من التجارب المماثلة التي يتم إجراؤها غالبا على الفئران.

سيوضح الإجراء الدكتور إريك غلاسكو الذي يدير منشأة أسماك الزرد الأساسية في جامعة جورج تاون. بعد تحضير الخلايا السرطانية والكواشف وأجنة الزرد وفقا لبروتوكول النص ، قم بتوصيل نظام توزيع الحقن الدقيق بمصدر هواء مضغوط ، وقم بتشغيل مصدر الطاقة. اختبر الضغط عن طريق الضغط على دواسة القدم.

يجب أن تنبعث نبضة قصيرة من الهواء من حامل الإبرة. أضف 20 مل من محلول 2X Tricaine إلى لوحة الحقن ، وضع اللوحة على شاكر لتوازنها. ثم كرر التوازن مع حصة ثانية من 2X Tricaine.

بعد ذلك ، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل مجموعة من الأجنة إلى طبق صغير يحتوي على محلول 2X Tricaine. باستخدام طرف تحميل الهلام، قم بإعادة ملء إبرة الحقن الدقيقة بالخلايا السرطانية. ضع الإبرة في وعاء تخزين قطب كهربائي بحيث يكون الطرف المدبب متجها لأسفل حتى تستقر الخلايا بالقرب من الحافة.

انقل 20 إلى 30 جنينا مخدرا إلى صفيحة حقن عن طريق جمع الأجنة التي تحتوي على الكثير من 2X Tricaine في ماصة بلاستيكية. اسمح للأجنة بالاستقرار على طرف الماصة ثم طرد الأجنة برفق في قاع صفيحة الحقن ، ونشر الأجنة على طول الحوض الصغير. قم بمحاذاة الأجنة بحيث تكون الرؤوس متجهة لأعلى والبطون تواجه الجدار شديد الانحدار للحوض الصغير.

قم بتوصيل الإبرة بحامل الإبرة للمناور الصغير. بعد ذلك ، ضع لوحة الحقن أسفل المجسم مع جدار 60 درجة إلى اليسار وركز على الجنين العلوي بتكبير 25X. ضع المعالج الصغير بحيث تخترق الإبرة الجنين عند تمديدها.

ثم مد الإبرة بالعين حتى تكاد تلامس الجنين. الآن ، أثناء النظر تحت المجهر ، قم بمحاذاة الإبرة مع الجنين. لحقن الخلايا ، اخترق حوض الجنين من خلال كيس الصفار.

اضغط على دواسة القدم ، مع وضع الطرف فقط في الجيب قبل القلب ، ولكن ليس فيه. ستطرد قوة الحقن الخلايا إلى الجيوب الأنفية القلبية. بدلا من ذلك ، يسمح حقن الخلايا في كيس الصفار بدراسة جوانب مختلفة من غزو الأوعية الدموية كما هو موضح في المخطوطة.

باستخدام اليد اليمنى ، قم بتمديد وإبرة الحقن وسحبها. باستخدام اليد اليسرى ، قم بإجراء تعديلات دقيقة لوضع الجنين التالي. عند حقن اللوحة بأكملها ، أعد الإبرة إلى جرة تخزين القطب.

لنقل الأجنة إلى طبق التعافي ، قم بإمالة لوحة الحقن لسحب الأجنة في الأسفل ، وغسل أي أجنة من الحوض الصغير ، واستخدام الماصة البلاستيكية لجمعها. اسمح للأجنة بالاستقرار في قاع الماصة ، ثم انقل الأجنة إلى طبق الاسترداد بكمية قليلة من التريكايين. احتضان طبق التعافي عند 28 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، قبل فصل الأجنة القابلة للحياة عن الأجنة الميتة والحطام.

احتضن الطبق على حرارة 33 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتسجيل. بعد تخدير مجموعة من الأجنة المراد تسجيلها ، وفقا لبروتوكول النص ، ضع يرقة مخدرة على شريحة مجهر الاكتئاب في قطرة من التريكايين. توجيه اليرقات بشكل جانبي للحصول على التصوير الأمثل للمنطقة الذيلية.

ضع الشريحة على مجهر مضان مركب بعدسة موضوعية 10X. قم بتسجيل اليرقات عن طريق حساب عدد الخلايا السرطانية التي نجحت في غزو الأوعية الدموية عن طريق التركيز لأعلى ولأسفل عبر منطقة الذيل لتمييز الخلايا السليمة بوضوح. قم بإذابة محلول 1.5٪ agarose Tricaine واجعله يصل إلى 37 درجة مئوية.

بعد تخدير الأجنة كما كان من قبل ، قم بنقل الجنين في قطرة من محلول التريكايين إلى سطح التصوير. استخدم ماصة زجاجية لإزالة محلول التريكايين الزائد الذي يحتفظ بالجنين على سطح التصوير. ثم قم بتراكب قطرة واحدة من محلول الاغاروز المذاب فوق الجنين.

العمل بسرعة ، قبل أن يتبلمر الاغاروز ، استخدم أداة حساسة مثل فرشاة رمش لتوجيه الجنين بشكل جانبي للتصوير ، مع الحرص الشديد على ضمان تسطيح الجنين على طول سطح التصوير. عندما تتبلمر قطرة الاغاروز ، اغمرها في محلول التريكايين. أخيرا ، أخضع جنين الزرد الحي للتصوير المجهري.

من بين خطوط خلايا سرطان الثدي السبعة التي تم اختبارها لقدرتها على غزو الأوعية الدموية في أجنة أسماك الزرد ، أظهر خط خلايا MDA-MB-231 أكبر عدد من الخلايا السرطانية المنتشرة لكل جنين عند تقييمها ، بعد 96 ساعة من الحقن. لوحظ أيضا أن خلايا BT-474 غزت بسهولة المنطقة الذيلية للأجنة بينما كانت خطوط الخلايا الأخرى مثل MCF-7 و SK-BR-3 و T-47D طفيفة التوغل. في الفحص المعدل الذي يستخدم موقع حقن مختلف ، تم إجراء تجربة منافسة حيث تم حقن مجموعتين من خلايا MDA-MB-231 ، التي تختلف في قدرتها الغازية على الأوعية الدموية ، في وقت واحد في كيس صفار الأجنة النامية.

عند التسجيل ، تقرر أن خلايا MDA-MB-231 التي انتشرت في ظل ظروف الثقافة المتقاربة قبل الحقن ، أظهرت انخفاضا في التسرير في الدورة الدموية ، وبالتالي ، كان لها وجود منخفض في المنطقة الذيلية للأجنة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء حقن جنة الزرد في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام معايير صارمة ومتسقة عند تسجيل تسرب الخلايا السرطانية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن التحقق من صحة النتائج بشكل أكبر في نموذج الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الحقن وتسجيل التسرب ، مما يسمح للمرء باختبار القدرة الغازية للأوعية الدموية للخلايا السرطانية في أجنة الزرد.