أسلوب الشذرة إكسو: تحديد التفاعلات البروتين الحمض النووي مع قرب قاعدة زوج الدقة

الهدف العام لهذه التقنية الجينومية الوظيفية هو تحديد المواقع الجينومية الدقيقة التي يشغلها بروتين معين في الخلايا الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات تنظيم الجينات وعلم التخلق مثل كيفية تجميع آلية النسخ وعملها في سياق الكروماتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تكشف عن الموقع الجيني الدقيق لتفاعلات الحمض النووي للبروتين عند الدقة المسبقة القريبة من القاعدة مع خلفية منخفضة بشكل استثنائي.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن البروتوكول معقد ويتطلب الاهتمام بالتفاصيل طوال الوقت. لصوتنة المحللات النووية ، ابدأ بوضع محولات الراتنج في أنابيب البوليسترين سعة 15 مليلتر تحتوي على مستخلصات نووية. قم بتشغيل المحللات في حمام ماء مثلج بقوة متوسطة لمدة 30 ثانية و 30 ثانية لمدة 30 ثانية لمدة 15 دقيقة.

للتحقق من نتائج الصوتنة ، قم بنقل عينتين من 10 ميكرولتر من كل أنبوب إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بعكس الروابط المتشابكة عن طريق الجمع بين أول عينة 10 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر من TE-RNase A و 0.2 ميكرولتر من البروتيناز K. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف أربعة ميكرولترات من صبغة الحمض النووي 6X xylene.

إلى العينة الثانية التي تبلغ 10 ميكرولتر ، حافظ على الروابط المتشابكة عن طريق إضافة ميكرولترين من صبغة الحمض النووي 6X xylene. قم بتشغيل كلتا العينتين على هلام أغروز 1.5٪ عند 140 فولت لمدة 30 إلى 45 دقيقة تقريبا حتى تصبح صبغة البروموفينول في الأخيرة ثلاثة أرباع الطريق إلى أسفل الجل. إذا كانت الصوتنة ناجحة ، فقم بنقل المحللات الصوتية إلى أنبوبين مليلتر تحتوي على 150 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 والدوامة لخلطها.

بيليه الكروماتين غير القابل للذوبان والحطام عن طريق تدوير المحللات الصوتية عند 20 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم انقل المواد الطافية إلى أنبوبين جديدين من المليلتر. قم بتخزين العينات عند سالب 80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

لكل ترسيب مناعي للكروماتين أو تفاعل ChIP ، اجمع بين 1.5 مل من المستخلصات الصوتية مع اقتران حبة الأجسام المضادة في أنابيب 1.5 ملليلتر. احتضان الأنابيب على دوار أنبوب صغير بسرعة تسعة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تحقق بعد بضع دقائق للتأكد من أن العينات لا تتسرب وتختلط بشكل صحيح.

في اليوم التالي ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة جدا لتجميع السائل في الأغطية ووضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. ثم استنشق المستخلص. أضف 0.75 مل من المخزن المؤقت RIPA إلى كل أنبوب.

ثم قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي واقلبها عدة مرات لخلطها. بعد دوران قصير ، ضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس واستنشق المادة الطافية. بعد الغسيل الأخير ، أضف 0.75 مل من 10 ملليمولار Tris HCL إلى كل أنبوب.

قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي واقلب العينات عدة مرات لخلطها. بعد دوران قصير ، ضع الأنابيب مرة أخرى على الرف واستنشق المادة الطافية. بعد إجراء تفاعلات التلميع والتفصيل وفقا لبروتوكول النص ، املأ حسابات مزيج الربط الرئيسي.

ثم قم بعمل مزيج الربط في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج والماصة لخلط المحلول. مع أنابيب العينة على الرف المغناطيسي ، أضف 48 ميكرولترا من مزيج الربط الرئيسي P7 وميكرولترين من مؤشر محول مختلف لكل من راتنجات العينة. احتضان العينات في ThermoMixer بدرجة حرارة ثلاثة أضعاف جم في 25 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد غسل العينات وإجراء تفاعلات إصلاح النك Phy 29 والكيناز وفقا لبروتوكول النص ، املأ حسابات مزيج نوكلياز لامدا الرئيسي وقم بعمل مزيج نوكلياز خارجي لامدا في أنبوب 1.5 مل على الجليد. أضف 50 ميكرولترا من مزيج نوكلياز خارجي لامدا إلى كل عينة من الراتنج بينما لا يزال على الرف المغناطيسي. ثم احتضان العينات في ThermoMixer بمعدل ثلاث مرات جم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد شفط الغسيل الأخير كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإجراء تفاعل نوكلياز RecJf عن طريق ملء حسابات المزيج الرئيسي RecJf وعمل مزيج RecJf على الجليد. أضف 50 ميكرولترا من مزيج RecJf إلى كل عينة من الراتنج على الرف المغناطيسي. ثم احتضان العينات في ThermoMixer بمعدل ثلاث مرات جم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد شفط الغسيل الأخير ، قم بإعداد مخزن الشطف ChIP ومزيج البروتيناز K الرئيسي وأضف 200 ميكرولتر من المحلول إلى كل عينة من الراتنج. احتضان العينات في ThermoMixer بمعدل ثلاث مرات جم في 65 درجة مئوية طوال الليل بغطاء ساخن لمنع التكثيف. في اليوم التالي ، قم بتدوير العينات لفترة وجيزة وضع الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.

ثم انقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. بعد استخراج الحمض النووي ، والامتداد الأساسي P7 وتفاعلات ATL ، املأ حسابات المزيج الرئيسي لجدول ربط محول P5 وقم بعمل مزيج الربط الرئيسي على الجليد. أضف 20 ميكرولترا من مزيج الربط إلى كل عينة وماصة للخلط.

ثم احتضان العينات في جهاز تدوير حراري عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين. إجراء تنقية الحمض النووي وقياسه الكمي وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح هنا ، يجدر قضاء بعض الوقت لتحسين ظروف الصوتنة للحصول على مستخلصات كروماتين عالية الجودة تنتج شظايا الحمض النووي بين 100 إلى 500 زوج أساسي.

ويستخدم مقايسة تحول الحركة الكهربية للتحقق من أن المستخلصات الصوتية تحتوي على روابط متشابكة للحمض النووي للبروتين سليمة ، والتي يتضح من ذلك على أنها تحول فائق في شظايا الحمض النووي. لتقييم إشارة الخلفية ، يتم إجراء ChIP وهمي بشكل روتيني بدون جسم مضاد في التفاعل. ستنتج مكتبة ChIP الخارجية عالية الجودة خلفية قليلة جدا في العينة الوهمية مقارنة بإعداد مكتبة ChIP-seq.

يظهر هنا تقييم محلل حيوي لمكتبة ChIP-exo. يضمن التحليل بدقة توزيع حجم المكتبة ويكتشف ثنائيات المحول الملوثة التي تعمل في 125 زوجا أساسيا. توضح هذه اللوحة التوزيع السلس لعلامة ChIP-exo المفصولة عن الخيوط خمسة Ns أولية للبوليميراز II و TFIIB و TBP في جين RPS12 البشري في خلايا K562 المتكاثرة.

يظهر في هذا الشكل متوسط أنماط ChIP-exo بالنسبة لمواقع بدء النسخ لجينات ترميز البروتين. تعكس مواقع الذروة الرئيسية ل TBP و TFIIB و polymerase II في المخطط المركب التنظيم الجيني لمجمعات بدء النسخ البشري. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تنظيم الجينات لاستكشاف التفاصيل الجزيئية للبنية دون النووية في قياس الأسيمتر في الخميرة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل RNase البحث عن توصيف التعبير لمعالجة أسئلة مثل ما إذا كان عامل معين يؤثر على التعبير عن جين قريب. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ملء جداول المزيج الرئيسية بعناية لجميع الخطوات الأنزيمية.

لا تنس أن العمل مع المواد المسرطنة والعوامل الكاوية الأخرى يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة الفيديو هذا ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مكتبة ChIP-exo عالية الجودة.