إنتاج وبلورة وتحديد هيكل C. صعب PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء
December 30th, 2016
الهدف العام من هذا الإجراء هو تنمية بلورات جودة حيود شعرية واحدة بكفاءة من البرولين المؤتلف البرولين endopeptidase-1, أو rPPEP-1, بروتين. بدون هذه الطريقة, rPPEP-1 تنتج على الفور بلورات متداخلة للغاية غير مناسبة لتحليل حيود الأشعة السينية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن عددا كبيرا من البلورات المرتبة جيدا والحيود بشكل جيد للتحديد الهيكلي ل rPPEP-1 يمكن إنتاجها في فترة زمنية قصيرة ومع مدخلات مادية محدودة.
هذا الإجراء يجعل من الاستفادة من طريقة microcity ويمكن تكييفها مع كل حالة تبلور أولية ناجحة من rPPEP-1 فضلا عن مجمعات الببتيد الركيزة. يمكن تكييف هذه الطريقة لإنتاج بلورات جيدة الترتيب من كل بروتين تقريبا ينتج بلورات متشابكة. يمكن استخدامه أيضا في تجارب البذر المتقاطع ، أو تباين البروتين ، أو في تجارب التبلور المشترك مع الجزيئات الصغيرة.
يعدالعرض البصري للتعامل مع طرق التبلور أمرا بالغ الأهمية ، حيث يمكن أن يكون للاختلافات الصغيرة تأثير كبير على جودة حيود البلورات. قم بإجراء تجارب البلورة بتنسيق قطرة الجلوس باستخدام الشاشات القياسية المتوفرة تجاريا وروبوت التبلور. أولا ، قم بتركيز البروتين المنقى إلى 12 ملليغرام لكل مليلتر باستخدام جهاز ترشيح فائق بالطرد المركزي على فترات خمس دقائق عند 4000 مرة جم وأربع درجات مئوية.
امزج البروتين بعد كل فاصل لمنع هطول الأمطار والتفاقم. حدد تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام معامل الانقراض 25 ، 900 لكل سنتيمتر مولي. بعد موازنة البروتين إلى 20 درجة مئوية ، قم بإزالة جميع الجسيمات والغبار عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 16000 مرة جم و 20 درجة مئوية.
لأداء شاشات الكريستال ، استخدم ألواح التبلور المعبأة مسبقا محكمة الغلق والمخزنة عند أربع درجات مئوية. عند إعداد الإصدارات التجريبية، اعمل بسرعة، حيث تجف الأحجام الصغيرة بسرعة. استخدم أيضا غرفة رطوبة حول قفص الروبوت، إن أمكن.
بعد موازنة جميع ألواح التبلور إلى 20 درجة مئوية ، قم بإعداد الشاشة عن طريق سحب خزان البروتين في الآبار الفرعية من اثنين إلى أربعة. استخدم حجم قطرة 300 نانولتر. استخدم نسب البروتين إلى الخزان من 200: 100 للبئر الثاني ، و 150: 150 للبئر الثالث ، و 100: 200 للبئر الفرعي الأربعة.
أغلق الطبق على الفور وضعه في غرفة عند 20 درجة مئوية. افحص الصواني بعد الإعداد كل يوم خلال الأسبوع الأول ثم اتبعه بالفحص الأسبوعي. من أجل التبلور المشترك لمجمعات الببتيد rPPEP-1 الركيزة, خلط rPPEP-1 في 24 ملليغرام لكل مليلتر في نسبة 1:1 مع سبعة أضعاف المولار الزائدة من محلول الببتيد تسريح مسحوق المجفف بالتجميد في محلول ملحي مخزنة تريس.
بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية ، قم بإزالة جميع الجسيمات والغبار عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 16000 مرة جم و 20 درجة مئوية. المضي قدما في التبلور باستخدام نفس إجراء البذر الدقيق كما هو الحال بالنسبة لبروتين rPPEP-1 غير المرتبط. ظهرت بلورات متشابكة للغاية من rPPEP-1 بعد يومين في حالة تحتوي على 2.4 مولار فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة و 0.1 مولار ثلاثي الحداثة الرقم الهيدروجيني 8.5.
لتحسين الحالة الأولية، استخدم برنامجا لحساب الأحجام ومخطط سحب العينات للحصول على ملليلترين من كل حالة تسمح ب 10 شاشات تحسين. تشمل الشروط 1.8 إلى 2.55 مولار فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة في خطوات 0.15 مولار بالإضافة إلى 0.1 مولار الرقم الهيدروجيني ثلاثي الحداثة 7.5 إلى 9.0 في خطوات 0.5 وحدة الأس الهيدروجيني. قم بإعداد شاشة شبكية تتكون من 24 شرطا من حلول المخزون.
استخدم مخطط سحب العينات لتكوين الظروف الفردية. ماصة 200 ميكرولتر من كل محلول شاشة شبكية في آبار صفيحة 24 بئرا وتوازن اللوحة عند 20 درجة مئوية. قم بإعداد لوحة التبلور يدويا.
استخدم حجم قطرة يبلغ ثلاثة ميكرولترات ونسبة بروتين إلى خزان تبلغ 2: 1 و 1.5: 1: 5 و 1: 2. هنا ، استخدم ماصة الإزاحة الموجبة لتجنب تكوين فقاعة الهواء. أغلق اللوحة على الفور.
ثم ضع الطبق في حجرة على حرارة 20 درجة مئوية. بعد يوم إلى أربعة أيام ، تظهر بلورات متشابكة للغاية من rPPEP-1 في الظروف الأربعة التي تحتوي على 2.55 فوسفات الأمونيوم المولي ثنائي القاعدة و 0.1 درجة الحموضة ثلاثية البترول المولارية 7.5 إلى 9.0 ، في حين لا تتشكل بلورات في الظروف ال 20 المتبقية. قم بإجراء البذر الدقيق للحصول على بلورات مفردة من rPPEP-1 في هذه الظروف.
لتحضير مخزون البذور الدقيقة ، اختر أولا بلورة واحدة متداخلة من إحدى الظروف الناجحة. بعد ذلك ، انقل 50 ميكرولترا من الخمور الأم المعنية إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على حبة زجاجية صغيرة مصقولة للغاية وميكرولتر واحد من الخمور الأم إلى شريحة الغطاء الزجاجي. باستخدام مزلق نايلون مركب ، قم بإخراج البلورة ونقلها إلى القطرة الموجودة على شريحة الغطاء الزجاجي.
ثم انقل السائل الذي يحتوي على البلورة إلى الأنبوب والدوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية ، مع التأكد من دوران الخرزة الزجاجية. قم بتخفيف 1: 1000 من مخزون البذور في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر يحتوي على نفس الحالة المحضرة حديثا والدوامة جيدا لمدة خمس ثوان. بعد ذلك ، قم بإزالة ختم اللوحة التي تغطي 20 حالة بقطرات واضحة.
ماصة 0.5 ميكرولتر من مخزون البذور في الآبار. أغلق الطبق وضعه في حجرة على حرارة 20 درجة مئوية. بعد تطبيق تقنية البذر الدقيق هذه ، تظهر بلورات مفردة ذات جودة حيود عالية بعد عدة ساعات إلى عدة أيام بعد الإعداد في ظروف مختلفة ، تحتوي على 1.8 إلى 2.4 فوسفات أمونيوم مولار و 0.1 مولار من الرقم الهيدروجيني 7.5 إلى تسعة.
تنمو البلورات إلى حجم 100 إلى 200 ميكرون في البعد الأكبر. اختر الحجم الأمثل لحلقة النايلون لأقصى طول للبلورات المختارة عن طريق وضع الحلقة على شريط الختم فوق البلورة مباشرة والتركيز لأعلى ولأسفل. أطول وصول نموذجي لبلورات rPPEP-1 هو حوالي 100 إلى 200 ميكرون.
قم أيضا بإعداد حالة التبريد المناسبة. املأ نفايات الرغوة بالنيتروجين السائل. ثم قم بتحميل مشبك القارورة بقارورة وقم بتبريدها مسبقا في نيل رغوة مملوء بالنيتروجين السائل سعة 800 مل.
ضع حامل cryocane مميز بمعرف مناسب وغطاء التبريد في نيل الرغوة المملوء بالنيتروجين السائل سعة لترين. ثم قم بتحميل العصا المغناطيسية بحلقة النايلون المثبتة بالحجم المناسب. بعد ذلك ، قم بقطع شريط الختم الموجود على لوحة التبلور بمشرط حاد وإزالته بالملقط.
ماصة ميكرولتر واحد من حالة التبريد على شريحة الغطاء. من المهم بشكل خاص العمل بسرعة في هذه الخطوة ، لأن تجفيف البلورة أو الحجم الصغير من محلول التبريد في الحلقة يمكن أن يؤدي إلى تقلبات في جودة البلورة أو حتى فقدان كامل للحيود. يجب تنفيذ جميع خطوات معالجة البلورات تحت المجهر الاستريو.
إذا التصقت البلورة بالسطح البلاستيكي ، فقم بفصلها عن الأرض عن طريق تشويه البلاستيك المحيط بإبرة الوخز بالإبر. قم بإزالة البلورة من القطرة عن طريق صيدها باستخدام حلقة النايلون المثبتة. انقل البلورة بسرعة إلى قطرة الثلاجة واتركها تتوازن لمدة ثانية واحدة.
ثم قم باصطياد البلورة من القطرة باستخدام حلقة النايلون المثبتة في أسرع وقت ممكن. قم على الفور بتجميد البلورة المسترجعة في النيتروجين السائل. عندما يتوقف النيتروجين السائل حول الحلقة المركبة عن الغليان ، ضع الحلقة في القارورة.
ضع القارورة على حامل الكريوكان. بمجرد تحميل الحامل بست قوارير ، ضع الأكمام المبردة حول الحامل. قم بتخزين البلورات في خزان مملوء بالنيتروجين السائل حتى الاستخدام.
لإجراء جمع البيانات ، قم باسترداد البلورة المركبة بعناية من الكريوكان باستخدام المشبك وتخزينها في نيل رغوي للنقل. حرك نقطة توقف الشعاع والكاشف إلى وضع الحديقة وحرك فوهة التبريد لأعلى بمقدار بضعة ملليمترات. قم بتركيب قاعدة غطاء التبريد على رأس مقياس الزوايا عن طريق الاحتفاظ بالقاعدة بأصابعك مع إزالة القارورة بسرعة.
ثم حرك فوهة التبريد وتوقف الشعاع مرة أخرى إلى مكانها وتوسيط البلورة. في جميع الأوقات ، احرص على عدم لمس مانع الشعاع أو الكاشف. تابع جمع مجموعة بيانات 180 درجة بزاوية تذبذب 0.1 درجة ، كما هو موضح هنا.
تظهر هنا بلورات rPPEP-1 المتشابكة للغاية التي تم الحصول عليها من الفحص الأولي باستخدام شاشات التبلور التجارية في 1.4 سترات الصوديوم ثلاثي القاعدة ثنائي الهيدرات ، 0.1 مولار HEPES الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.5. تظهر هنا بلورات تم الحصول عليها من الفحص الأولي بنسبة 60٪ من الحجم إلى الحجم ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 0.1 مولية BIS-TRIS البروبان ، ودرجة الحموضة 7.0. ظهرت البلورات أيضا في 2.4 مولار فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة ، 0.1 مولار تريس ، درجة الحموضة 8.5.
بعد تطبيق إجراء تحسين البذر الدقيق ، تم احتواء بلورات مفردة في عدة ظروف ، بما في ذلك 2.1 مولار فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة ، 0.1 مولار تريس ، درجة الحموضة 8 ، و 2.25 مولار فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة ، 0.1 مولار تريس ، درجة الحموضة 8. يتراوح حجم البلورات المثبتة في حلقات النايلون من 100 إلى 200 ميكرون ويبدو أنها تحتوي على شبكة واحدة من الفحص المجهري. يظهر تحليل حيود الأشعة السينية أن هذه البلورات تظهر بالفعل شبكة واحدة وأشعة سينية متعرجة بالقرب من الدقة الذرية.
حل الهيكل البلوري لمركب الببتيد الركيزة PPEP-1 المؤتلف يعطي نظرة ثاقبة لوضع ربط الركيزة PPEP-1. يمكن أن ينتشر ببتيد الركيزة في مجموعة ربط الركيزة PPEP-1 في تأكيده المفتوح. ثم كما يحدث إغلاق حلقة, الركيزة يتفاعل مع PPEP-1 عبر الروابط الهيدروجينية وشبكة سلسلة الجانب الأليفاتية العطرية فريدة من نوعها الموجودة على S-حلقة.
ترتبط الركيزة في شكل مزدوج ملتوي فريد من نوعه مع مكامن الخلل في رابطة الببتيد الأزيز ورابطة الببتيد الأولية P2 إلى P3. بعد مشاهدة هذا الفيديو, يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج شعرية واحدة بئر الحيود بلورات المؤتلف PPEP-1 للدراسات الهيكلية. يمكن استخدام طرق مماثلة مع البروتينات الأخرى ، مما ينتج عنه بلورات متداخلة للغاية ودرجة حرارة حضانة متنوعة وتخفيف مخزون C.
نظرا لتعدد استخداماتها وسهولة استخدامها ، يجب تجربة هذه التقنية البسيطة في كل عملية تحسين للبلورات.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة إنتاج وتحديد بنية البروتين برولينبرولين إندوبيبتيداز-1 (PPEP-1)، وهو بروتين قابل للتحلل من كلوستريديوم صعب. ينصب التركيز على طريقة لنمو بلورات عالية الجودة من البروتين PPEP-1 المؤتلف لتحليل الانعراج بالأشعة السينية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأحياء البنيوي
- بلورات البروتين
- الكيمياء الحيوية
الخلفية
- PPEP-1 هو بروتين قابل للتحلل مجهز بإنزيم محتمل كهدف دوائي.
- بلورة rPPEP-1 صعبة بسبب البلورات المتداخلة.
- نمو البلورات الفعّال ضروري للتحليل البنيوي.
- يمكن تكييف طريقة microcity لمختلف ظروف البلورة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لإنتاج بلورات ذات جودة عالية لتحليل الانعراج من المنظومة البلورية المفردة من rPPEP-1.
- تمكين تحديد البنية لـ rPPEP-1 ومعقداته مع الركيزة.
- توفير نهج متعدد الاستخدامات يمكن تطبيقه على البروتينات الأخرى التي تنتج بلورات متداخلة.
الطرق المستخدمة
- طريقة microcity لنمو البلورات.
- التكيّف لظروف البلورة الأولية.
- تجارب التلقيح المتقاطع.
- بلورة مشتركة مع جزيئات صغيرة.
النتائج الرئيسية
- إنتاج فعّال للبلورات منظمة جيدًا من rPPEP-1.
- عدد كبير من البلورات المناسبة لتحليل الانعراج بالأشعة السينية.
- طريقة قابلة للتطبيق في مختلف سيناريوهات بلورة البروتين.
- إمكانية لتطبيقات أوسع في علم الأحياء البنيوي.
الاستنتاجات
- تحسن الطريقة المطورة بشكل كبير من جودة البلورات لـ rPPEP-1.
- يمكن أن يعزز هذا النهج الدراسات البنيوية للبروتينات الأخرى.
- يمكن للبحوث المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية في اكتشاف الدواء.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Determining the atomic structure of virulence factors like C. difficile PPEP-1 enables structure-guided inhibitor design to reduce pathogenicity. Reliable production of diffraction-quality crystals is a prerequisite for fragment screening and lead optimization in anti-infective programs. This microseeding protocol addresses a common bottleneck in structural biology by converting intergrown crystals into single-lattice forms suitable for X-ray diffraction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of PPEP-1's substrate binding mode through high-resolution structural data.
- Operational Value: Provides pure, active protein in sufficient quantities for biophysical assays and inhibitor screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates well-ordered crystals capable of near-atomic resolution X-ray diffraction for detailed active-site mapping.
- Operational Value: Uses microseeding to optimize crystallization conditions with limited protein input, increasing throughput.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by revealing how substrate peptides interact with PPEP-1 via hydrogen bonds and aliphatic-aromatic networks.
- Operational Value: Produces crystals suitable for ligand soaking or co-crystallization to evaluate inhibitor binding.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the structural biology workflow from protein production to lead identification, enabling iterative cycles of crystallization, data collection, and structure-based design.
- Discovery Biology: Facilitates target validation by providing structural insights into PPEP-1 function and inhibition mechanisms.
- Screening: Yields crystals compatible with fragment screening and X-ray diffraction data collection for hit identification.
- Analytics: Delivers electron density maps that reveal substrate binding conformations and potential inhibitor interaction points.
- Translational Research: Connects atomic-level structural data to preclinical inhibitor optimization through defined binding modes.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other proteins prone to intergrown crystal formation, broadening utility across targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protease-substrate interactions through clear visualization of binding modes.
- Operational Value: Enables reproducible production of single-lattice crystals from initially poor crystallization hits.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by providing high-quality structural data for computational docking and medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target druggability assessments, supporting risk-adjusted investment decisions.
Implementation Considerations
- Expertise in protein purification, crystallization screening, and microseeding techniques.
- Access to crystallization robots, imaging systems, and X-ray diffraction beamlines.
- Standardization of protein concentration, drop ratios, and seeding protocols across teams.
- Adaptation of buffer conditions (e.g., ammonium phosphate, Tris pH) for different protein targets.
- Limitations include dependency on initial crystallization hits and optimization time for seed stock preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Initial Screening of rPPEP-1 and Co-crystallization of rPPEP-1 with Ligands Using Commercial Screens
3:54
Crystal Optimization Using Microseeding
7:35
Crystal Mounting
10:45
Results: Evaluation of rPPEP-1 Crystal Growth Using Optimization Procedure
12:48
Conclusion
