تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين
فبراير 20, 2017
في هذه الورقة ، أبلغنا عن بروتوكول يصف طريقة في الجسم الحي لقياس عدم الاستقرار الديناميكي للأنابيب الدقيقة في خلايا سرطان الثدي المقاومة للدوسيتاكسيل (MCF-7TXT). في هذه الطريقة ، يتم استخدام نظام التصوير المجهري لإزالة الالتفاف للكشف عن التعبير عن توبولين GFP في الخلايا المستهدفة.
الهدف العام من هذه التجربة هو قياس عدم الاستقرار الديناميكي للأنابيب الدقيقة في خلايا سرطان الثدي المقاومة للدوسيتاكسيل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية حول عدم الاستقرار الديناميكي للأنابيب الدقيقة في ظل الظروف الفسيولوجية ، واتباع العلاجات الدوائية المختلفة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر بروتوكولا بسيطا وموثوقا وقابلا للتطبيق من الناحية الفسيولوجية لدراسة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الخلايا الحية.
قبل البدء في الإجراء ، قم بزراعة خلايا سرطان الثدي في وسط مزرعة كاملة في أطباق مزرعة 10 سم عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون إلى درجة الالتقاء مناسبة. في اليوم السابق للتجربة ، اشطف الغطاء الزجاجي المطلي ب 24 ملم بولي L-lysine بالكحول بنسبة 70٪ وعرض الزلات للأشعة فوق البنفسجية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، ضع غطاء واحد في كل بئر من ستة ألواح آبار.
ثم اغسل الثقافات باستخدام PBS ، وافصل الخلايا في كل طبق باستخدام 0.5 مل من التربسين EDTA. عندما تبدأ الخلايا في الرفع من قاع اللوحة ، قم بتحييد التربسين بخمسة ملليلتر من وسط الزراعة الطازج واحسب الخلايا. ثم أضف ما يقرب من 10 خلايا خامسة إلى كل زلة غطاء ، وقم بهز اللوحة برفق ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 36 ساعة على الأقل.
لفحص ديناميكيات الأنابيب الدقيقة للخلايا ، قم بخلط محلول مخزون ألفا توبولين الموسوم ب GFP عدة مرات عن طريق الانعكاس لضمان حل متجانس دون دوامة. ثم استبدل وسط الاستزراع في كل بئر بملليلترين من الوسط الطازج الذي يحتوي على 40 ميكرولتر من توبولين العلامة. رج اللوحة برفق للسماح بالخلط الكامل للعلامة مع وسط الثقافة وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى.
في اليوم التالي ، استبدل وسط الاستزراع بوسط طازج يحتوي على دوسيتاكسيل وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة. أثناء تثبيط الخلايا ، قم بتشغيل المجهر الفلوري المقلوب ، وقم بتسخين حامل العينة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. ثم حدد العدسة ذات الهدف الزيتي 60X 1.42 NA وقم بتركيب زلة الغطاء الأولى على حامل العينة.
قم بتغطية العينة بملليلتر واحد من الدوسيتاكسيل الطازج 37 درجة مئوية المحتوي على وسط وحدد موقع مجموعة من الخلايا المسطحة التي تظهر كثافة مضان ألفا توبولين عالية تحمل علامة GFP مع هياكل أنابيب دقيقة مرئية بوضوح. ركز على المنطقة الطرفية لإحدى الخلايا في نظام المجموعة، واضبط وقت التعريض الضوئي المناسب في تردد الحصول على الصورة. بالضبط بعد 50 دقيقة من إضافة أول حصة من docetaxel ، ابدأ في تسجيل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لمدة دقيقتين ، والحصول على صورة كل ثانيتين.
عندما يتم الحصول على جميع الصور ، قم بتصوير الخلية التالية كما هو موضح للتو ، حتى يتم التقاط صور لخمس خلايا من جميع الآبار الثلاثة لكل تركيز دوسيتاكسل. عندما يتم الحصول على جميع الصور لكل تركيز مثبط ، افتح برنامج إزالة الالتفاف ، داخل نظام المجهر وانقر فوق العملية. بعد ذلك ، حدد deconvolve واسحب ملف الصورة إلى نافذة الإدخال.
انقر فوق do لفك الالتفاف للصورة ، وافتح ملف الصورة غير الملتوي داخل برنامج المجهر. انقر فوق ملف واحفظه كفيلم. قم بتعيين تنسيق الفيلم على أنه AV ونمط الحركة إلى الأمام.
اضبط جودة الضغط على 100٪ ومعدل الإطارات على خمسة في الثانية. ثم حدد مربع الحركة من خلال الوقت وانقر فوق القيام بذلك لإنشاء الفيديو. في هذه التجربة التمثيلية ، تم علاج خلايا سرطان الثدي الطبيعية والمقاومة للدوسيتاكسيل باستخدام دوسيتاكسيل وتم تصويرها كما هو موضح للتو ، ولكن آثار العلاج على نمو الأنابيب الدقيقة وتقصيرها ، أكثر وضوحا في الخلايا غير المقاومة للدوسيتاكسيل.
في الواقع ، يكشف قياس معدل نمو الأنابيب الدقيقة وتقصيرها تحت ظروف علاج دوسيتاكسيل 0.5 ميكرومولار عن تثبيط قوي لديناميكيات التوبولين للخلايا الأبوية ولكن ليس الدوسيتاكسيل. بمجرد إتقان العملية ، يمكن إكمال العملية بأكملها في غضون 60 ساعة إذا تم تنفيذ التقنيات بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار الخلايا المسطحة ، ذات كثافة مضان التوبولين GFP العالية ، وتقليل شدة مضان الإثارة ومدة التعرض لتجنب تلاشي مضان GFP.
منذ تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات بيولوجيا الخلايا والسرطان لتقييم تأثيرات عوامل استهداف الأنابيب الدقيقة المختلفة على الخلايا الطبيعية والسرطانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس عدم الاستقرار الديناميكي للأنابيب الدقيقة في الخلايا الحية في ظل مجموعة متنوعة من الظروف.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لقياس عدم الاستقرار الديناميكي للأنيبيبات الدقيقة في خلايا سرطان الثدي المقاومة لدواء docetaxel باستخدام مجهر إزالة الالتفاف (deconvolution microscopy). تركز هذه الطريقة على التعبير عن GFP-tubulin في الخلايا الحية، مما يوفر رؤى حول سلوك الأنيبيبات الدقيقة تحت تأثير العلاج الدوائي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث السرطان
- تقنيات المجهر
خلفية علمية
- تلعب الأنيبيبات الدقيقة دوراً حاسماً في بنية الخلية ووظيفتها.
- تمثل مقاومة دواء Docetaxel تحدياً كبيراً في علاج سرطان الثدي.
- يمكن أن يساهم فهم ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة في تطوير الاستراتيجيات العلاجية.
- يتيح GFP-tubulin التصوير المباشر لسلوك الأنيبيبات الدقيقة في الوقت الحقيقي.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لدراسة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الخلايا الحية.
- استقصاء آثار العلاجات الدوائية على عدم استقرار الأنابيب الدقيقة.
- تعزيز فهم بيولوجيا الخلايا السرطانية.
الطرق المستخدمة
- التصوير الحي (In vivo) للأنيبيبات الدقيقة باستخدام مجهر إزالة الالتفاف (deconvolution microscopy).
- زراعة خلايا سرطان الثدي المقاومة لعقار الدوسيتكسيل (MCF-7 TXT).
- تعبير بروتين GFP-tubulin لأغراض التصوير المرئي.
- تحضير شرائح تغطية مطلية بالبولي-إل-لايسين (poly L-lysine) لالتصاق الخلايا.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الخلايا الحية.
- إثبات عدم استقرار الأنابيب الدقيقة استجابةً للمعالجة الدوائية.
- تأسيس بروتوكول يمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا.
- رؤى حول آليات مقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لدراسة ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة.
- تساهم النتائج في فهم سلوك الخلايا السرطانية تحت تأثير العلاج.
- يمكن أن تستند الأبحاث المستقبلية إلى هذه الطريقة لاستكشاف استراتيجيات علاجية أخرى.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر قياس عدم الاستقرار الديناميكي للأنيبيبات الدقيقة في الخلايا السرطانية الحية مقايسة ذات صلة فسيولوجياً لتقييم آليات مقاومة العوامل التي تستهدف الأنيبيبات الدقيقة (MTA). يتيح هذا النهج التحقق من صحة الهدف من خلال ربط سلوك الأنيبيبات الدقيقة بالاستجابة الدوائية، مما يعزز الثقة التنبؤية في الفحص قبل السريري لـ MTA. كما تساعد هذه الطريقة في تقليل المخاطر المرتبطة بالعلاجات القائمة على التاكسان من خلال تحديد الأنماط الظاهرية للمقاومة في مرحلة مبكرة من الاكتشاف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضية العلاجية من خلال قياس معدلات نمو وتقصير الأنيبيبات الدقيقة عند التعرض لعقار docetaxel.
- القيمة التشغيلية: استخدام التعبير عن tubulin المسمى بـ GFP في الخلايا الحية لتمكين التصوير في الوقت الفعلي والقابل للتطبيق فسيولوجياً دون حدوث شوائب التثبيت.
- القيمة التنبؤية: التمييز بين الأنماط الظاهرية الحساسة لـ docetaxel والأنماط المقاومة له بناءً على تثبيط ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة، مما يدعم تقييم الثقة في الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يضع بروتوكولاً قياسياً لقياس ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة في خلايا سرطان الثدي الملتصقة باستخدام مجهر إلغاء الالتفاف (deconvolution microscopy).
- المخرجات الكمية: يولد بيانات الفاصل الزمني (time-lapse) التي تمكن من قياس معدلات نمو وتقاصر الأنيبيبات الدقيقة كقراءات وظيفية.
- تطبيق الفحص: يدعم تقييم تأثيرات MTA على عدم استقرار الأنيبيبات الدقيقة في الخلايا الحية، مما يسهل عملية فحص المركبات أو الأنماط الجينية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يمثل مقاومة التاكسان في خلايا سرطان الثدي المشتقة من MCF-7، مما يعكس آليات المقاومة الملحوظة سريريًا.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين التغيرات في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة وبين التوقف الانقسامي ومقاومة الموت الخلوي المبرمج الناجم عن الدوسيتكسل.
- قرارات معدلة حسب المخاطر: يتيح التحديد المبكر للأنماط الظاهرية للمقاومة، مما يوجه قرارات الاستمرار أو التوقف في برامج تطوير اتفاقيات نقل المواد (MTA).
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف، ومروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التقييم قبل السريري، لا سيما بالنسبة للعوامل التي تستهدف الأنابيب الدقيقة حيث ترتبط آلية المقاومة بتغير ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات حول سلوك الأنابيب الدقيقة كمحدد للاستجابة الدوائية في الخلايا الحية.
- الفحص: يوفر نظاماً جاهزاً للمقايسة لقياس التغيرات في عدم استقرار الأنابيب الدقيقة عقب الاضطراب الناجم عن المركبات أو التدخل الجيني.
- التحليلات: يتيح قياس معدلات نمو وتقاصر الأنابيب الدقيقة كمخرجات كمية ذات دقة زمنية لمقارنة الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط قياسات عدم الاستقرار الديناميكي بالنتائج الوظيفية مثل التوقف الانقسامي والموت الخلوي المبرمج في الخلايا المقاومة مقابل الخلايا الحساسة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام، يمكن تطبيقها على فئات متعددة من MTA ونماذج خلوية تتجاوز سرطان الثدي المقاوم لـ docetaxel.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف من خلال ربط ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بالنمط الظاهري للعقار في سياق فسيولوجي.
- القيمة التشغيلية: تقدم بروتوكولاً موثوقاً وموحداً للتصوير الحي للخلايا بأقل قدر من المعدات المتخصصة بخلاف مجهر الفلورة.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من الغموض الميكانيكي في مقاومة MTA، مما يسمح بتقليل المخاطر في مرحلة مبكرة وتحسين كفاءة رأس المال في برامج علاج الأورام.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات للمرشحات من MTA بناءً على المخاطر المعدلة من خلال تحديد آليات المقاومة قبل الدراسات الحيوية in vivo.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصوير الخلايا الحية، والمجهر الفلوري، وبيولوجيا الأنابيب الدقيقة.
- يعتمد على توفر مجهر فلوري مقلوب مزود بعدسة زيتية، وغرفة بيئية، وبرنامج لإزالة الالتفاف (deconvolution).
- يستلزم توحيد معايير استزراع الخلايا، والتعبير عن GFP-tubulin، وتوقيت المعالجة الدوائية عبر جميع التجارب.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع أنواع الخلايا المختلفة، أو علامات الأنابيب الدقيقة، أو أنماط التصوير.
- يتقيد بمخاطر التبييض الضوئي (photobleaching)، مما يتطلب تحكماً دقيقاً في شدة الاستثارة ومدة التعريض كما هو موضح في البروتوكول.
