إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء خلايا رباعية الصبغيات التكاثرية ، خالية من مجموعات ثنائية الصبغيات ، من الخلايا الليفية البشرية الطبيعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث التسرطن ، مثل كيفية تطور خلايا اختلال الصيغة الصبغية في المراحل المبكرة من التسرطن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا التكاثرية رباعية الصبغيات ، الخالية من المجموعات ثنائية الصبغيات ، يمكن إنشاؤها من خلال إجراءات بسيطة نسبيا.

في حين أن بعض السلالات تصبح رباعي الصبغيات تماما عن طريق العلاج البسيط بسم المغزل ، ديميكولسين ، فإن معظمها يحتاج إلى التعامل معه بطريقة التخليص أثناء هذا العلاج لمحاكاة السكان ثنائيي الصبغيات. لبدء تحريض رباعي الصيغة الصبغية بدون طريقة التخليص ، قم بالمرور حوالي خمس مرات 10 إلى 1/5 الخلايا المزروعة في طبق 100 ملم. احتضن الطبق في جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، عالج الخلايا التي تنمو أضعافا مضاعفة بوسط يحتوي على 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر تيار مستمر ، واحتضن في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. ثم استبدل الوسط المحتوي على التيار المستمر بوسط خال من الأدوية. احتضان في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية حتى يستأنف الانتشار.

للحث على رباعي الصيغة الصبغية باستخدام طريقة التخليص ، قم بتمرير الخلايا المستنبتة إلى قوارير T-75 ، مع التأكد من أن كل قارورة تحتوي على مرة واحدة على الأقل 10 إلى 1/6 خلايا. احتضان القوارير في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، عالج الخلايا ذات الوسط الذي يحتوي على التيار المستمر لمدة 16 إلى 18 ساعة لإيقافها في الانقسام كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد الحضانة ، افحص الخلايا في قارورة تحت مجهر تباين الطور المقلوب. ثم هز كل قارورة برفق لبدء جمع الخلايا الانقسامية غير اللاصقة. يجب تجنب التعامل غير المبالي ، مثل الاهتزاز العنيف أو لمس سطح القارورة بواسطة طرف الماصة.

لا تلوث الخلايا الانقسامية بخلايا الواجهة الملتصقة. اغسل القوارير برفق بوسط دافئ ، وانقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي. استخدم عداد الخلايا الذرية لحساب رقم الخلية.

بعد عد الخلايا ، جهاز الطرد المركزي عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. أعد زرع الخلايا الانقسامية المجمعة في أطباق استزراع 16 ملم. ثم عالج الخلايا المطلية بوسط يحتوي على 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر DC.احتضان في 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

بعد ذلك ، استبدل الوسط المحتوي على التيار المستمر بوسط خال من الأدوية. احتضان في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى يستأنف الانتشار. لتحليل صيغة الحمض النووي ، اغسل الخلايا باستخدام PBS.

ثم أضف محلولا يحتوي على 0.05٪ تريبسين و 0.02٪ EDTA إلى الخلايا. احتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي.

وتحييد التربسين بإضافة وسيط يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. الطرد المركزي للخلايا في وسط 300 مرة غرام لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من PBS.

ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS. أضف أربعة ملليلتر من 100٪ من الإيثانول مع الخلط.

دع التعليق يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لإصلاح الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا في محلول مثبت عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. وإعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من PBS.

الطرد المركزي التعليق عند 300 مرة غرام لمدة خمس دقائق. ثم عالج الخلايا ب 475 ميكرولتر من 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من محلول الحمض النووي الريبي. أضف 25 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر من محلول اليود البروبيديوم لتلطيخ الخلايا.

ثم اخلطي. اترك التعليق يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، استخدم مقياس التدفق الخلوي مع ليزر 488 نانومتر ومرشح انبعاث القناة الحمراء لتحليل محتوى الحمض النووي للخلايا.

قم بتحليل عينة مرجعية محضرة من الخلايا ثنائية الصبغيات الأصلية أيضا لتقييم ploidy للخلايا المستهدفة. للبدء ، عالج الخلايا التي تنمو بشكل كبير بوسط يحتوي على 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر تيار مستمر لمدة أربع ساعات لإيقاف الخلايا في الطور الطوري. بعد ذلك ، احصد ما لا يقل عن خمس مرات 10 إلى 1/5 خلايا عن طريق التربسين.

الخلايا المحصودة في وسط يحتوي على FBS. الطرد المركزي التعليق عند 300 مرة غرام لمدة خمس دقائق. ثم أضف خمسة ملليلتر من محلول كلوريد البوتاسيوم 0.075 مولار.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد اكتمال الحضانة ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من مثبت كارنوي.

ثم قم بالطرد المركزي للتعليق عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من مثبت كارنوي. قم بإسقاط 30 ميكرولترا من تعليق الخلية على شريحة زجاجية.

أخيرا ، قم بتلطيخ الخلايا وتحليلها إما عن طريق عدد الكروموسومات أو تحليل النمط النووي. في هذه الدراسة ، يتم زراعة الخلايا رباعية الصبغيات التكاثرية ، الخالية من السكان ثنائيي الصبغيات ، من الخلايا الليفية البشرية الطبيعية. على الرغم من أن بعض سلالات الخلايا يمكن أن تصبح رباعي الصبغيات تماما عن طريق العلاج المستمر بالتيار المستمر ، إلا أن معظم الخلايا تحتاج إلى المعالجة بطريقة التخلص أثناء علاج التيار المستمر للقضاء على مجموعة ثنائية الصبغيات.

التمثيلية لتحريض رباعي الصيغة الصبغية في ثلاث سلالات من الخلايا الليفية موضحة هنا. تصبح سلالة TIG-1 رباعي الصبغيات بالكامل تقريبا من خلال العلاج المستمر البسيط مع DC.ومع ذلك ، فإن هذا العلاج يتسبب في أن تصبح سلالات BJ و TIG-hT مزيجا من مجموعات ثنائية الصبغيات ورباعية الأرجل. لذلك ، فإن عزل الخلايا الانقسامية بطريقة التخليص ضروري أثناء عملية العلاج.

يتم إجراء عدد الكروموسومات في الخلايا رباعية الصبغيات القائمة. كما يتضح ، فإن رقم الكروموسوم المشروط هو 92 لكل من خلايا TIG-1 و BJ ، و 91 لخلايا TIG-hT. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوعين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر هز القوارير برفق في خطوة التخليص ، حتى لا تتسبب في تلوث الخلايا الانقسامية بواسطة خلايا الواجهة الملتصقة.