الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد أنابيب نانوية كربونية أحادية الجدار الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء للاستشعار الجزيئي التي تم تشغيلها باستخدام بوليمرات المحاكاة الحيوية. يمكن لهذه المستشعرات النانوية تمكين التصوير الذي تم حله بمرور الوقت في الأنسجة الحية. على سبيل المثال ، يمكن استخدامها للكشف عن الدوبامين في الدماغ.

الميزة الرئيسية لهذه المستشعرات هي تألقها المتأصل في الأشعة تحت الحمراء القريبة ، والتي تتيح التصوير بشكل أعمق في الأنسجة. تتيح المستشعرات الاصطناعية اكتشاف الجزيئات التي لا تحتوي على عناصر التعرف الجزيئي الطبيعية مما يجعل هذه الطريقة العامة لتطوير أجهزة الاستشعار مفيدة بشكل خاص للكشف عن الجزيئات الصغيرة. لتحضير معلق الحمض النووي ل SWNTs ، قم أولا بإذابة الأحماض النووية في 0.1 مولي كلوريد الصوديوم بتركيز 100 ملليغرام لكل مليلتر.

في غطاء الدخان ، قم بإزالة الكهرباء الساكنة من الملعقة التي تستخدم لمرة واحدة ، وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، ومخزون SWMT ، باستخدام مسدس مضاد للكهرباء الساكنة. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الحمض النووي إلى 980 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 0.1 مولار. ثم أضف 1 ملليغرام من SWNTs المغسولة إلى محلول الحمض النووي الناتج قبل صوتنة الخليط.

يعد وضع طرف المسبار أثناء الصوتنة أمرا بالغ الأهمية. في حالة حدوث رغوة ، أعد وضع طرف المسبار ، وحاول خفض السعة. بدلا من ذلك ، يمكنك تجربة نبضات صوتنة أو صوتنة الحمام إذا ظل التعليق ضعيفا.

باستخدام الموجات فوق الصوتية بطرف قطره 3 ملم ، قم بصوتنة المحلول لمدة 10 دقائق بسعة 40٪ في حمام جليدي. الطرد المركزي لمحلول الحمض النووي SWNT مرتين لمدة 90 دقيقة عند 16 ، 100 xg. اجمع المادة الطاففية واحتفظ بها, مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات التي تحتوي على حزم الأنابيب النانوية الكربونية والركام.

تخلص من الحبيبات وفقا لإجراءات النفايات الخطرة المؤسسية المناسبة للمواد النانوية. قم بقياس امتصاص المحلول عند 632 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية لتحديد التركيز التقريبي ل SWNTs المعلقة ، وفقا لقانون لامبرت بير ، وعامل التخفيف المناسب. بالنسبة لتعليق البوليمر البرمائي ، قم أولا بإزالة الكهرباء الساكنة من الملعقة التي تستخدم لمرة واحدة ، وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، ومخزون SWNT.

في غطاء الدخان ، أضف خمسة ملليغرامات من SWNTs إلى خمسة ملليلتر من محلول كولات الصوديوم 2٪. باستخدام الموجات فوق الصوتية بطرف قطره ستة ملليمترات ، قم بصوتنة المحلول لمدة ساعة واحدة بسعة 40٪ في حمام جليدي. الطرد المركزي العينة عند 150،000 xg لمدة أربع ساعات باستخدام جهاز طرد مركزي فائق ، قبل جمع المادة الطافية بعناية.

بعد ذلك ، قم بإذابة 1٪ من وزن البوليمر البرمائي في محلول scSWNT. بعد ذلك ، قم بغسيل الكلى بمحلول البوليمر scSWNT باستخدام غشاء غسيل الكلى 3.5 كيلو دالتون مقابل لتر واحد من الماء منزوع الأيونات أو المخزن المؤقت لمدة خمسة أيام. قم بتغيير الماء أو المخزن المؤقت في الساعة الثانية وفي الساعة الرابعة.

قم بقياس امتصاص المحلول عند 632 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV-Vis لتحديد التركيز التقريبي ل SWNTs المعلقة. لتحضير الشرائح المطلية بالبيوتين BSA ، قم بتنظيف شريحة مجهر وغطاء زجاجي 0.17 ملم بالماء منزوع الأيونات ، متبوعا بالميثانول والأسيتون والشطف النهائي للماء منزوع الأيونات. قم بإنشاء قنوات عن طريق وضع عدة قطع من الشريط اللاصق على الوجهين على بعد خمسة ملليمترات تقريبا على شريحة المجهر النظيف.

أغلق القنوات عن طريق أخذ زلة غطاء زجاجي طويلة والضغط عليها على الجزء العلوي من الشريط على الوجهين. تأكد من توسيطه على شريحة المجهر بحيث لا تكون حواف الغطاء المنزلق والانزلاق متدفقة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول مخزون BSA-biotin إلى 900 ميكرولتر من 1x Tris buffer إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل مليلتر.

قم بتدفق 50 ميكرولترا من محلول BSA-biotin في القناة عن طريق سحب المحلول في أحد طرفيه وفتيل المحلول في الطرف الآخر باستخدام منديل. بعد احتضان المحلول لمدة خمس دقائق ، قم بإجراء ثلاث إلى خمس عمليات تدفق باستخدام 50 ميكرولتر من 0.1 كلوريد الصوديوم المولاري. بعد ذلك ، قم بتخفيف 40 ميكرولترا من خمسة ملليغرام لكل مليلتر محلول مخزون NAV إلى 960 ميكرولتر من 1x Tris buffer ، إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر.

قم بتدفق 50 ميكرولترا من محلول NAV إلى القناة عن طريق سحب المحلول في أحد طرفيه والتخلص من المحلول في الطرف الآخر باستخدام منديل. بعد احتضان الشريحة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق ، قم بإجراء ثلاث إلى خمس عمليات تدفق باستخدام 50 ميكرولتر من 0.1 كلوريد الصوديوم المولاري. بعد ذلك ، قم بتخفيف محاليل مخزون SWNTs المعلقة ومخزن التصوير إلى تركيز من 1 إلى 10 ملليغرام لكل لتر.

قم بتدفق 50 ميكرولترا من هذا المحلول في القناة واحتضنه لمدة خمس دقائق. اشطف SWNTs الزائدة برفق باستخدام 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير. لقياس الاستجابة العكسية ل GT15 DNA-SWNTs للدوبامين ، قم أولا بتركيب القنوات المطلية بالمستشعر على مرحلة المجهر الفلوري.

اجعل القنوات في التركيز باستخدام كاميرا 100X Oil Objective وكاميرا زرنيخيد الغاليوم الإنديوم. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الدوبامين 100 ميكرومولار في محلول ملحي مخزن بالفوسفات إلى قناة التدفق ، وسجل التغيير في شدة التألق. اغسل محلول الدوبامين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، ولاحظ التغيير في مضان مستشعرات SWNT الفردية.

لإجراء فحص لوحة البئر للاستجابة التحليلية ل SWNTs البوليمرية المقلدة الحيوية ، قم بإدخال أحجام متساوية من مستشعر SWNT المعلق في كل بئر. استخدم حجما كافيا لتغطية قاع البئر بشكل موحد. بعد ذلك ، يتم تحليل الماصة من مكتبة الفرز إلى ألواح البئر.

قم بإعداد كل مادة تحليلية في ثلاث نسخ لحساب التباين المحتمل في البئر إلى البئر وتقلبات شدة الإثارة أو درجة الحرارة. ارفع الهدف أثناء مراقبة أطياف الانبعاثات باستخدام مقياس الطيف ومصفوفة زرنيخيد الغاليوم الإنديوم. سيضع الموضع الأمثل للهدف المستوى البؤري تقريبا في منتصف حجم العينة في البئر ، والذي يجب أن يتوافق مع الحد الأقصى في الكثافة المقاسة.

لكل عينة بئر ، سجل تعريضا من ثانية إلى 10 ثوان لجمع الطيف. قارن أطياف الانبعاثات لكل بئر بعنصر تحكم يحتوي على SWNTs فقط بدون تحليل إضافي ، لتحديد استجابة التألق. يظهر طيف الامتصاص لمستشعرات الأنابيب النانوية للحمض النووي GT15 قمما متعددة تتوافق مع أنابيب نانوية كربونية مشتتة جيدا ذات تباين اللون.

يظهر التألق القريب من الأشعة تحت الحمراء لمستشعرات الأنابيب النانوية GT15 DNA. ومن المثير للاهتمام أن شدة التألق تتضاعف تقريبا استجابة للدوبامين. في هذا الشكل ، يكشف الفحص المجهري الفلوري القريب بالأشعة تحت الحمراء عن مستشعرات أحادية للأنابيب النانوية GT15 DNA مثبتة على سطح زلة الغطاء الزجاجي.

من الآن فصاعدا ، من المهم اختبار المستشعر للاستخدام في الجسم الحي ، على سبيل المثال توسيع مكتبة التحليل لتشمل المنافسين الجزيئيين ، واختبار خطية الاستجابة في نظام التركيز ذي الصلة بيولوجيا ، وكذلك اختبار الانعكاس. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذا النهج لإنشاء مكتبة من أجهزة الاستشعار الاصطناعية المختلفة من الجزيئات التي لا تحتوي على عناصر التعرف الجزيئي المعروفة.