جمع Serum- وخالية من تغذية الفأر الجنينية الجذعية المتوسطة مكيفة الخليوي لنهج خالية من خلية

تتمثل الأهداف العامة لهذا البروتوكول في جمع الوسط المكيف من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في ظل ظروف زراعة خالية من المصل والمغذي وتوصيف الوظائف البيولوجية لهذه الوسيلة. يوفر هذا الإجراء نظرة ثاقبة حول النشاط المضاد للشيخوخة للعوامل القابلة للذوبان التي تفرز من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر لتطوير نهج علاجي آمن وخالي من الخلايا للأمراض المرتبطة بالعمر. سيوضح هذا الإجراء الدكتور يون أوي باي ، أستاذ باحث في مختبري.

في غطاء السلامة البيولوجية ، عالج الخلايا الليفية الجنينية للفأر أو مزرعة الخلايا MEF ب 20 مل من وسط MEF مكمل بميتومايسين C في طبق زراعة خلية 15 سم لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وافصلها بثلاثة ملليلتر من التربسين EDTA لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية. تحييد التربسين بستة ملليلتر من وسط MEF الطازج عندما ترفع الخلايا من أسفل اللوحة.

بعد جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط MEF والصفيحة مرتين في 10 إلى سادس MEFs معطل لكل طبق استزراع 10 سم في وسط MEF الطازج. استزراع الخلايا المغذية لمدة 24 ساعة. ثم استبدل وسط MEF بوسط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر والبذور مرتين في 10 إلى الخلايا الجذعية الجنينية السادسة للفأر على المغذيات لمدة 48 ساعة على الأقل من الزراعة المشتركة.

في غطاء السلامة البيولوجية ، اشطف صفيحة من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر بخمسة ملليلتر من PBS وافصل الخلايا باستخدام التربسين بالإضافة إلى EDTA كما هو موضح للتو. بعد جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات الخلايا الجذعية في خمسة ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الطازجة وقم بوضع ملليلتر واحد من الخلايا لكل طبق في وسط الخلايا الجذعية الجنينية الطازجة على خمسة أطباق زراعة الخلايا المطلية بالجيلاتين. أعد الخلايا إلى الحاضنة حتى تصل التقاء المزارع إلى 80-85٪.

ثم اشطف الخلايا بما لا يقل عن ثمانية ملليلتر من PBS لكل طبق لثلاث غسلات لمدة 10 دقائق متبوعة بحضانة لمدة 24 ساعة في وسط مصل مخفض. بعد ما لا يزيد عن 24 ساعة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للطرد المركزي. متبوعا بالترشيح من خلال مصفاة علوية للزجاجة 0.2 ميكرومتر.

لاختبار تأثيرات الوسط المكيف للخلايا الجذعية الجنينية عن طريق اختبار بيتا جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ، قم بزرع الخلايا الليفية الجلدية البشرية في صفيحة من ستة آبار في وسط الخلايا الليفية الجلدية البشرية. بعد حضانة ليلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، استبدل نصف الوسط بوسط مكيف للخلايا الجذعية الجنينية للفأر الطازج لمدة 72 ساعة أخرى. في اليوم الثالث من الثقافة ، اشطف الخلايا في ملليلترين من PBS لكل بئر لمدة غسلتين لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، قم بتثبيت الخلايا في 3.7٪ بارافورمالدهيد لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان. بعد التثبيت ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام ملليلترين من PBS ، كما هو موضح للتو وقم بتسمية الخلايا بواحد إلى ملليلترين من محلول SA beta gal لمدة 17 ساعة ونصف عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون. في نهاية فترة التلوين ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS كما هو موضح للتو.

ثم ، قم بمقاومة البقعة باستخدام Eosen لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد مجموعة أخرى من غسلات PBS ، قم بتصوير الخلايا بتكبير 100 مرة بواسطة المجهر الضوئي. لتحليل دورة الخلية ، البذور ثمانية أضعاف 10 إلى رابع الخلايا الليفية الجلدية البشرية لكل بئر في طبق زراعة الخلايا بطول ستة سنتيمترات في وسط الخلايا الليفية البشرية الطازجة لحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في صباح اليوم التالي ، استبدل نصف الوسط بوسط مكيف للخلايا الجذعية الجنينية للفأر وأعد الخلايا إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق تفكك التربسين EDTA متبوعا بغسلتين في مليلتر واحد من محلول PBS. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول PBS البارد بعد الغسيل الثاني.

بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا باستخدام تطبيق القطرة الحكيم عند 200 ميكرولتر من الإيثانول البارد أثناء الدوامة. قم بتخزين الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة على الأقل. ثم اغسلها في محلول PBS الطازج.

بعد الطرد المركزي الثاني ، قم بمعالجة الحبيبات ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لسترات الصوديوم المكمل ب RNase لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة ، قم بتسمية الخلايا ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لسترات الصوديوم الذي يحتوي على يوديد البروبيديوم لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتقييم مراحل دورة الخلية لكل عينة عن طريق قياس التدفق الخلوي.

لتحليل PCR للنسخ العكسي الكمي ، استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المعالجة بوسط الخلايا الليفية الجلدية البشرية المعالجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج. بعد ذلك ، قم بصياغة خليط التفاعل الذي يحتوي على أوليغو ديوكسي ثيميدين بادئات و M-MLV العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

ثم أضف ميكروغراما واحدا من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على خليط التفاعل. أخيرا ، قم بقياس تضخيم CDNA باستخدام جهاز PCR في الوقت الفعلي باستخدام مزيج PCR الرئيسي الأخضر والبادئات الجينية المناسبة. تظهر الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المزروعة في ظل ظروف زراعة الخلايا الجذعية الجنينية الطبيعية للفئران على طبقة خلية مغذية MEF شكلا بيضاويا ومظهرا لامعا.

بينما تظهر الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المزروعة في ظل ظروف الثقافة الخالية من المصل والمغذي مورفولوجيا مسطحة وغير منتظمة. يؤدي علاج الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة السن بالوسط المشروط للخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى تقليل عدد الخلايا الإيجابية للبيتا غالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة. علاوة على ذلك ، يكشف تحليل دورة الخلية لهذه الخلايا أن العلاج المتوسط المشروط بالخلايا الجذعية الجنينية للفأر يزيد بشكل كبير من عدد الخلايا في مرحلتي S و G2 / M مع تقليل عدد الخلايا في مرحلة G0 / G1.

بالإضافة إلى ذلك ، يقلل العلاج الوسيط المشروط بالخلايا الجذعية الجنينية للفأر من التعبير عن الجينات المرتبطة بالشيخوخة والسيتوكينات السكرتيرة المرتبطة بالنمط الظاهري للشيخوخة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا أن تتذكر جمع المصل والوسط الخالي من التغذية بعد 24 ساعة ، حيث أن الحضانة الطويلة تزيد من احتمالية التحلل الذاتي للخلية أو موت الخلايا المبرمج عن طريق الجوع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع المصل والمغذي الوسط المكيف للخلايا الجذعية الجنينية للفأر لنهج خال من الخلايا.

لا تنس أن العمل مع كاشف مثل بارافورمالدهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات ، مثل التعامل مع هذا الكاشف في غطاء الدخان ، يجب دائما اتخاذ الإجراءات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.