العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في عزل وتوصيف خلية غير تقليدية داخل الظهارة ، وهي مجموعة من الخلايا التائية جاما دلتا من عينة فرشاة باطن عنق الرحم البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في فهم الأحداث المناعية داخل حجرة باطن عنق الرحم داخل الظهارة ، للمساعدة في تصميم استراتيجيات فعالة للوقاية من العدوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر أداة قوية وفعالة لدراسة الخلايا الليمفاوية غاما دلتا التائية داخل باطن عنق الرحم ، في المختبر.

ستظهر الإجراء لورا روميرو ، باحثة مشاركة أولى في مختبري. مباشرة بعد التجميع ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الفرشاة الخلوية على الجليد. في غضون ساعة واحدة من التجميع ، قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على الفرشاة الخلوية لمدة أربع نبضات مدة كل منها 10 ثوان.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب ، وقم بإزالة الفرشاة بعناية دون إزعاج اللوحة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من وسط IMDM إلى الخلايا ، وضع الأنبوب على الجليد. ضع الفرشاة الخلوية فوق مصفاة خلية 100 ملم في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، واغسل الفرشاة ب 20 مل من IMDM الطازج.

الطرد المركزي الغسيل. إعادة تعليق اللوحة في مليلتر واحد من IMDM الطازج ، وتجمع مع الغسيل مع الخلايا الموجودة في أنبوب جمع الفرشاة الخلوية الأصلي. لتحليل خلايا باطن عنق الرحم عن طريق قياس التدفق الخلوي ، قم بنقل واحد إلى ثلاثة مرات في 10 إلى الخلايا الخامسة في 100 ميكرولتر من عازلة الفاكس لكل أنبوب خمسة مليلتر ، وقم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة وصبغة البقاء ذات الأهمية لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للمجموعة. بعد تدوير الخلايا ، قم بصب المادة الطافية تماما. استخدم الخرز والأجسام المضادة للتحكم IgG المناسبة لضبط ضوابط التعويض.

بعد ذلك ، قم بتحميل الأنبوب الأول ، واضبط البوابة على إجمالي عدد خلايا باطن عنق الرحم في مخطط مبعثر أمامي إلى جانب ، متبوعا باستبعاد مزدوجات الخلية. استبعاد الخلايا الميتة وفقا لتعبير صبغة قابليتها للحياة ، والبوابات على الخلايا الحية الإيجابية CD45 و CD3 الإيجابية. يتم تعريف خليتين موجبتين لدلتا جاما ودلتا جاما على أنهما مجموعات سكانية فرعية للخلايا الموجبة CD3 التي تعبر عن دلتا جاما TCR.

لعزل خلايا جاما دلتا التائية عن طريق عزل الخرزة المغناطيسية ، قم بإعادة تعليق ما يصل إلى مرة واحدة في 10 إلى السابع خلايا باطن عنق الرحم التي تم حصادها حديثا في 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت لمجموعة TCR دلتا جاما MicroBead. باتباع تعليمات الشركة المصنعة لبروتوكول التلوين المكون من خطوتين ، قم بتسمية الخلايا بجسم مضاد مضاد ل TCR جاما دلتا هابتين ، متبوعا بMicroBeads المترافق المضاد ل hapten FITC لمدة 15 دقيقة عند أربع إلى ثماني درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للمجموعة ، وصب المادة الطافية تماما.

أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمجموعة ، وقم بتطبيق تعليق الخلية مباشرة على عمود حبة مغناطيسي تم وضعه في مغناطيس الفاصل المناسب ، وجمع التدفق في أنبوب جديد. عندما تمر جميع الخلايا عبر العمود ، اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الطازج ، وقم بتجميع الغسالات مع الخلايا المجمعة. لجمع خلايا جاما دلتا التائية ، انقل العمود إلى أنبوب مخروطي الشكل ، واستخدم مكبس العمود لطرد الخلايا التائية من العمود باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت الجديد.

لعزل خلايا جاما دلتا التائية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، قم بتسمية الخلايا بصبغة قابلة للحياة ، في لوحة الجسم المضاد كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، قم بفرز الخلايا وفقا لصبغتها القابلة للحياة ، وإيجابية CD45 و CD3 و جاما دلتا. يمكن اكتشاف مجموعة فريدة من خلايا جاما دلتا V1 التي تعبر عن الخلايا التائية بسهولة في عينات الخلايا البشرية لباطن عنق الرحم.

يكشف التحليل الظاهري التفصيلي للخلايا الإيجابية CD3 الموجبة لدلتا جاما أن غالبية هذه الخلايا سلبية CD4 و CD8. يؤدي فصل الخرزة المغناطيسية لخلايا باطن عنق الرحم ، كما هو موضح للتو ، إلى تنقية ما يقرب من 98٪ من خلايا دلتا جاما TCR نقية. يمكن أيضا تحقيق هذا المستوى من النقاء عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، مما يتحقق من صحة استخدام أي من التقنيتين لعزل خلايا جاما دلتا التائية باطن عنق الرحم.

ومن المثير للاهتمام ، أن تحليل الخلايا داخل ظهارة باطن عنق الرحم ، وخلايا جاما دلتا التائية ، التي تم حصادها من الإناث المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية وضوابط المتبرعين الأصحاء ، يوضح انخفاضا طفيفا في أعداد هذه الخلايا المهمة وقابليتها للبقاء في الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر معالجة العينة بسرعة ، وإبقاء الخلايا على الجليد طوال الإجراء بأكمله ، للحفاظ على صلاحية الخلية بشكل جيد.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل فرز الخلية المفردة جنبا إلى جنب مع تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال عالي الحساسية ، للإجابة على أسئلة إضافية حول المسارات الالتهابية والإشارات داخل حجرة باطن عنق الرحم داخل الظهارة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فيروس نقص المناعة البشرية والأمراض المعدية لاستكشاف علامات الخلايا الجديدة لضعف الغشاء المخاطي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة من عينة فرشاة باطن عنق الرحم البشرية.