استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

الهدف العام من هذا الفحص الوظيفي في المختبر هو تقييم الجوانب المختلفة للبلعمة بوساطة FC. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات أمراض الدم المناعية وطب نقل الدم مثل الأهمية السريرية للأجسام المضادة الذاتية والأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء. توفر هذه التقنية فحصا بيولوجيا وظيفيا يمكن إجراؤه في المختبر للتنبؤ بنتيجة نقل الدم لدى المرضى الذين لديهم أجسام مضادة مسبقة التكوين ضد خلايا الدم الحمراء.

ستظهر الإجراء سيندي تونغ ، طالبة دراسات عليا من مختبري. الآن لا تنس أن العمل بدم الإنسان يمكن أن يكون خطيرا وأن الاحتياطات مثل ارتداء العباءات والقفازات الواقية يجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد الحصول على عينة دم كاملة من 10 ملليلتر من متبرع سليم في أنابيب فراغ تحتوي على سكر العنب الحمضي سيترات عن طريق بزل الوريد ، يتم وضع الأنابيب في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية ويتم تخفيف الدم بنسبة واحد إلى واحد في وسط دافئ كامل.

بعد ذلك ، قم بسحب خلايا الدم ببطء على جانبي أنبوب الطرد المركزي على تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة ، مع الحرص على عدم خلط الطبقات. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، تخلص من طبقة البلازما العلوية واستخدم ماصة باستور زجاجية لنقل PBMC التي تحتوي على طبقة مصفاة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل.

اغسل PBMCs المعزولة ثلاث مرات في PBS ، مع تعليق الخلايا في ثلاثة إلى سبعة ملليلتر من الوسط بعد الطرد المركزي الثالث. بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى 1.75 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر في وسط كامل وقم بزرع 400 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من شريحة من ثماني غرف لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع رطوبة كاملة. لمعالجة خلايا الدم الحمراء R2R2 ، اغسل أولا خلايا الدم الحمراء ثلاث مرات في PBS.

بتخفيف حبيبات R2R2 بعد الطرد المركزي الثالث بنسبة واحد إلى واحد باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل D من المصل البشري لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع الخلط المتقطع. في نهاية التظليل ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة ثم اغسلها ثلاث مرات أخرى في PBS كما هو موضح للتو. أعد تعليق الحبيبات إلى حجم 1.25٪ إلى الحجم في وسط RPMI كامل.

بعد ذلك ، استبدل المادة الطافية من كل بئر من الشريحة المكونة من ثماني غرف ب 400 ميكرولتر من خلايا R2R2 المرجعية لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، استخدم محولات الشرائح لإزالة الغرف ، وقم بمسح R2R2 الزائد بمنشفة ورقية. الآن ، املأ دورق سعة 100 مل ب PBS واغمس كل شريحة ببطء 30 إلى 40 مرة في محلول الملح لإزالة غالبية R2R2 غير البلعمة.

بعد التجفيف ، قم بتثبيت الشرائح في 100٪ من الميثانول لمدة 45 ثانية واترك الخلايا تجف قبل تركيب العينات بأغطية. في اليوم التالي ، قم بتحميل كل شريحة على مجهر تباين الطور باستخدام عدسة موضوعية 40X وقم بحساب ما لا يقل عن 200 خلية وحيدة يدويا وعدد R2R2 البلعمية داخل كل خلية وحيدة باستخدام عداد واحد في كل يد لتحديد عدد الخلايا الوحيدة وعدد خلايا R2R2 البلعمة في نفس الوقت لكل عينة. يرتبط الغلوبولين المناعي الوريدي بمستقبلات FC التي تمنع البلعمة بطريقة تعتمد على الجرعة مع تثبيط ما يقرب من 100٪ لوحظ بدءا من تركيزات 200 ميكروغرام من الغلوبولين المناعي الوريدي لكل مليلتر وبدون تثبيط تقريبا بتركيزات أقل من 0.5 ميكروغرام من المثبط.

عندما يتم تطبيع مؤشرات البلعمة إلى التحكم الإيجابي R2R2 على أنه تثبيط 0٪ ، يمكن تحديد منحنى تثبيط مع IC 50 من ثلاثة ميكروغرام لكل مليلتر. من خلال الخبرة ، يمكن استخدام المجهر المتباين الطور لتمييز الخلايا الوحيدة عن خلايا الدم الحمراء الملوثة والفجوات من خلايا الدم الحمراء البلعمة. يجب تجنب مجموعات الخلايا الكثيفة والحطام أثناء القياس الكمي وكذلك الإفراط في التظليل لخلايا الدم الحمراء R2R2 مما قد يؤدي إلى زيادة البلعمة التي تزدحم الجزء الداخلي من الخلايا الوحيدة وتتداخل مع تحليل البلعمة الدقيق.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ست إلى ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء الخلوية المناعية أو التألق المناعي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير عن البروتين البلعمي وتفاعلات خلايا الدم الحمراء والتجزئة. من خلال تطويرها الأولي وتحسينها الإضافي ، ستعلم هذه التقنية الطريقة التي يستكشف بها الباحثون في مجالات طب نقل الدم وبيولوجيا الخلية أنظمة التبصرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار أحادي الطبقة أحادية الخلية لتقييم أنواع تفاعل الأجسام المضادة التي تثير البلعمة.