المعادن التصوير في أنسجة المخ عن طريق الاستئصال بالليزر - إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي (LA-ICP-MS)

الهدف العام من هذه الطريقة هو قياس التوزيع المكاني للمعادن في المقاطع النسيجية باستخدام مطيافية الكتلة بالبلازما المقترنة حثياً مع الاستئصال بالليزر. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية في كل من البيولوجيا الأساسية وأبحاث الأمراض، لا سيما في الحالات التي تشارك فيها الكيمياء الحيوية للمعادن في باثولوجيا المرض. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في احتفاظها بالمعلومات المكانية عن المعادن، وهي المعلومات التي تُفقد عادةً عند استخدام تقنيات تحليل المعادن التقليدية.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج وتشخيص الأمراض التنكسية العصبية لأنها تسمح لنا بمراقبة كيفية تغير المعادن في مناطق الدماغ التي يظهر فيها موت الخلايا. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة في إعداد هذه التجارب الطويلة والمعقدة. لذا فإن العرض المرئي لهذه الطريقة يعد أمراً بالغ الأهمية، حيث يمكن أن يكون تصميم التجربة وتحليل البيانات أمراً صعباً لأن كل خطوة يجب أن تُنفذ بترتيب محدد.

أولاً، ضع عينة من نسيج الدماغ وجميع معايير الأنسجة المتطابقة مع المصفوفة في غرفة الاستئصال بالليزر. تأكد من أن العينات تقع ضمن عمق المجال الخاص بكاميرا LACCD. أغلق باب الغرفة وأحكم ربط البراغي يدوياً.

بعد ذلك، في برنامج ICPMS، افتح صمام الغاز الحامل واضبط معدل التدفق على 1.2 liters per minute. وفي برنامج LA، قم بإجراء عملية تطهير لخلية الاستئصال باستخدام الغاز الحامل لمدة 30 minute. وبالنسبة لخلية استئصال ذات حجمين، قم بتحريك منصة العينة إلى كل زاوية من زوايا الغرفة كل عشر دقائق لتقليل كمية الهواء المتبقي في الخلية.

قم بتشغيل جهاز ICPMS واتركه ليسخن لمدة ساعتين. وأثناء تسخين الجهاز، ارسم خط استئصال بطول ثلاثة مليمترات تقريباً عبر سطح المعيار النسيجي الأول باستخدام برنامج الاستئصال بالليزر. انقر فوق خط الاستئصال وقم بتعيين القطر الافتراضي للحزمة، وسرعة المسح، والتدفق الإشعاعي.

كرر الخط ست مرات، مع ترك مسافات بين الخطوط تعادل قطر الشعاع. كرر هذه العملية لكل عينة قياسية. بعد ذلك، استخدم أداة الخط لرسم منطقة الاستئصال فوق العينة، بدءاً من الزاوية العلوية اليسرى وعبر أوسع نقطة في العينة باستخدام نفس المعايير المتبعة في العينات القياسية.

كرر الخط حسب الحاجة لضمان التغطية الكاملة للعينة وبنفس التباعد المستخدم في المعايير. بعد ذلك، ارسم مجموعة من الخطوط للمسح المتقطع للمعايير في موعد لا يتجاوز 20 ساعة من مسح العينة، أو بين كل عينة وأخرى. أضف مسحاً للمعايير في نهاية التجربة.

بناءً على طول الخط وسرعة المسح، حدد وقت التحليل لخطوط العينة والمعايير. بعد ذلك، أنشئ دفعة جديدة في برنامج ICPMS، واختر التحليل المعتمد على الوقت (time resolved analysis). اختر قيم نسبة الكتلة إلى الشحنة المراد تحليلها، واضبط أوقات التكامل لكل نسبة، بحيث يكون إجمالي وقت التكامل لدورة واحدة 0.25 seconds.

احفظ المجموعة. بالنسبة للمجموعة القياسية، قم بتعبئة وقت التحليل لكل سطر مع إضافة فترة احتياطية مدتها 15 ثانية لمراعاة أوقات إحماء الليزر والغسيل. قم بتعيين قائمة تشغيل العينات مع تحديد عملية استحواذ لكل سطر قياسي.

بالنسبة لدفعة العينات، قم بتكرار دفعة المعايير، واضبط الأوقات وعدد مرات الحصول على البيانات بما يتناسب مع نمط الاستئصال الخاص بالعينة. وبمجرد تسخين جهاز ICPMS، أضف الدفعة الأولى إلى قائمة الانتظار، وتأكد من أن البرنامج في حالة انتظار لإشارة تحفيز من جهاز LA. بعد ذلك، وفي برنامج LA، قم بتشغيل مصدر طاقة الليزر، واضبط أوقات تسخين الليزر والغسيل.

ابدأ تسلسل الليزر، وتحقق من أن جهاز ICPMS يبدأ في جمع البيانات بشكل صحيح بعد عملية الاستئصال. وبمجرد جمع البيانات، استخرج بيانات المعايير من ملفات CSV. قم بإجراء خطوط الأساس للسحب، واستبعد إشارة الخلفية.

حدد انخفاضات الإشارة الناتجة عن الثقوب في معايير الأنسجة. قم بحجب هذه المناطق ذات الإشارة المنخفضة، ثم صَدِّر البيانات في شكل جدول بيانات. احسب عامل تحويل من CPS إلى PPM لكل عنصر تم تحديده.

كرر هذه العملية لكل معيار. بعد ذلك، افتح برنامج بناء الصور الكمية واستورد بيانات العينات من ملفات CSV. حدد عدة مناطق من الخلفية لتطبيق تصحيح الخلفية.

حدد أداة تحرير الرسم البياني، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة، ثم اختر تعديل مظهر الصورة. قم بتغيير اللون الأول عند Z إلى قيمة سالبة كبيرة، وانقر على تم لتحسين إشارة الخلفية. بعد ذلك، في علامة تبويب المعايير، أدخل عوامل تصحيح CPS PPM لكل معيار وانقر على ابدأ.

افتح متصفح البيانات في علامة تبويب البيانات، وانقر بزر الماوس الأيمن على ملف صورة مصحح، ثم انقر على "صورة جديدة". افتح نافذة تعديل مظهر الصورة وقم بتعيين جدول الألوان والمقياس. استخدم أداة إضافة التعليقات التوضيحية لوضع مقياس ألوان على الصورة.

قم بضبط مقياس الألوان في نافذة مقياس الألوان. وبمجرد تلوين الصورة وتدوين الملاحظات عليها، يمكنك إما نسخ الصورة ولصقها في برنامج آخر، أو تصدير الصورة من برنامج بناء الصور. لتنشيط أدوات المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، اختر معالجة الصور من حزم التحليل ثم حدد صورة.

في علامة تبويب الصور، انقر على ROI ثم ابدأ رسم ROI. حدد المنطقة المراد دراستها ثم انقر على finish ROI. في علامة تبويب الصور، انقر على stats للحصول على بيانات ROI.

انسخ البيانات والصقها في جدول بيانات، مع التأكد من الحفظ عند إضافة كل منطقة اهتمام (ROI). كرر هذه العملية حسب الحاجة. وقد تم استخدام هذه التقنية لاستقصاء محتوى المعادن وتوزيعها في دماغ فأر من النوع البري.

تظهر هنا توزيعات الكربون والمغنيسيوم والفوسفور بعدد العدات في الثانية. كما تظهر صور كمية لكل من المنجنيز والنحاس والحديد والزنك. وقد استُخدم توزيع الكربون كمعيار داخلي.

كان الحديد أكثر وفرة في الدماغ المتوسط والتلفيف المسنن. بينما كان الزنك أكثر وفرة في المناطق القشرية. ويمكن بعد ذلك استخدام المعلومات المستمدة من هذه الصور لتتبع تعبير ووظيفة البروتينات الرابطة للمعادن. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إعداد تجربة تمتد لعدة أيام في غضون ساعة واحدة عند تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم مزامنة خطوط الاستئصال وملفات البيانات الخاصة بك مع جهاز ICPMS. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق إضافية مثل التلوين النسيجي على المقاطع المجاورة من أجل توفير معلومات إضافية مثل التوضع المشترك للمعادن مع بروتينات محددة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا فحص كيفية تغير مستويات المعادن في النماذج المختبرية لمرض باركنسون.

على الرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة لاكتساب رؤى حول التحلل العصبي، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لأنواع مختلفة من الأنسجة والحالات المرضية، بما في ذلك الأنسجة البشرية ومجموعة من المصفوفات البيولوجية. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لفحص كيفية تغير مستويات المعادن في كل من العينات البشرية والنماذج الحيوانية للأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة جداً عن كيفية إعداد تجربة الـ laser ablation ICPMS.

لا تنسَ أن العمل مع المواد البيولوجية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.