نموذج للمحيط بالعصب الغزو في الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا

الهدف العام لهذا البروتوكول التجريبي هو التقييم السريع لحالات العلاج المتعددة التي تؤثر على الغزو حول العصب في سرطان حرشفية الرأس والرقبة مع معدلات نجاح عالية جدا في الفحص وقابلية التكاثر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أورام الرأس والرقبة ، مثل العوامل التي تؤثر على غزو الخلايا السرطانية حول العصب في الرأس والرقبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء عدد كبير من المقايسات بسرعة وتكرارا من فأر واحد في فترة زمنية قصيرة نسبيا.

قبل البدء في إجراء تشريح عقدة الجذر الظهري ، أو DRG ، أضف متوسطا جديدا بدرجة حرارة الغرفة إلى ما لا يقل عن 40 بئرا من صفيحة 96 بئر على شكل حرف V. ثم استخدم مقصا دقيقا لعمل شق طولي على طول العمود الفقري من جذر الذيل إلى رأس الفأر. وقم بتقسيم الأنسجة أسفل العمود الفقري العجزي بشكل عرضي ، وتشريح جانبي العمود الفقري ، وصولا إلى قاعدة الجمجمة.

انقل العينة تحت المجهر ، وراقب نهاية عنق الرحم للعمود الفقري بطاقة منخفضة. يظهر الحبل الشوكي الأبيض في منتصف حلقة عظمية محاطة بكميات متغيرة من العضلات حول العمود الفقري والأنسجة الرخوة. باستخدام مقص زنبركي مجهري ، قم بتقسيم الجانب الظهري أو العلوي لأول جسمين إلى ثلاثة أجسام فقرية.

بعد ذلك ، استخدم حركة الربيع للمقص لفتح هذا الجرح العظمي الأولي ، للتأكد من حدوث تشريح الجسم الفقري عند خط الوسط. استمر بزيادات صغيرة باتجاه العمود الفقري العجزي ، مع تقسيم العمود الفقري بجروح متطابقة على الجانب البطني أو السفلي من الأجسام الفقرية. ضع نصف النفطي جانبا ، انقل النصف الآخر من العمود الفقري ووجهه لأسفل على صفيحة معقمة مع وضع الحبل الشوكي في مكانه.

واستخدم إبرتين قياس 18 لتأمين طرفي نصف الدماغ على منصة تشريح البوليسترين. بعد ذلك ، بدءا من الطرف الضيق من عنق الرحم ، قم بتقشير الحبل الشوكي برفق من حوالي أربعة مستويات فقرية. في المنطقة التي يتم فيها إدخال الأعصاب الحسية في DRG ، أمسك اللفافة المحيطة برفق باستخدام ملقط مجهري ، واستخدم مقص زنبركي مجهري لتقليم هذه اللفافة والأنسجة العصبية الأخرى لتحرير DRG.

تحت زيادة التكبير ، استخدم مقص الزنبرك لقطع العصب المحيطي بالقرب من DRG قدر الإمكان لتحرير الأنسجة ، وتقليم الفروع القريبة. بعد ذلك ، قم بقص DRG من أي ألياف عصبية طائشة أو مرفقات لفافية وضع الأنسجة المعزولة في بئر واحد من اللوحة السفلية على شكل حرف V المكونة من 96 بئرا. لتحضير قطرات المصفوفة شبه الصلبة ، انقل صفيحة زجاجية واحدة من الجليد إلى كتلة جليدية تحت مجهر التشغيل.

ضع طرف ماصة لا تزيد عن 10 ميكرولتر مباشرة على الزجاج بزاوية 45 درجة، وقم بتوزيع قطرة مصفوفة سعة 1.5 ميكرولتر بعناية على الزجاج. حرك طرف الماصة ببطء بعيدا عن الزجاج عندما تصبح المصفوفة متشابكة مع اللوحة. قم بإيداع قطرة واحدة من المصفوفة على كل زاوية من الزوايا الأربع للوحة ، وانقل اللوحة إلى سطح درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

عندما تصلب المصفوفة قليلا ، أعد اللوحة إلى كتلة الجليد ، واستخدم ملقطا مجهريا مغلقا لغرف DRG برفق باليد اليسرى. باستخدام اليد اليمنى ، انقل الأنسجة العصبية بعناية إلى طرف إبرة قياس 21 واستخدم الإبرة لإدخال DRG برفق في منتصف قطرة المصفوفة. يجب أن يتم تحرير DRG بسهولة في المصفوفة لتحديد المواقع المركزية بالإبرة.

بعد إدخال قطعة DRG في كل قطرة من القطرات الأربع ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. عندما يتم تضمين كل DRG ، أمسك الألواح واحدة تلو الأخرى ، بزاوية طفيفة وأضف ببطء أربعة ملليلتر من DMEM مكملا بنسبة 10٪ FBS إلى الألواح ، بحيث يتلامس الوسيط تدريجيا فقط مع وحدات DRG المصفوفة. أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 48 إلى 72 ساعة أخرى.

عندما تصل العصبيات إلى 75٪ على الأقل من الطريق إلى حافة المصفوفة ، قم بشفط الوسط من الآبار دون إزالة وحدات DRG المصفوفة. بعد ذلك، باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر، مع زناد ناعم، ضع قطرتين من ثلاث مرات في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر من الوسط فوق كل مبالغ مصفوفة DRG. وأعد الأطباق إلى الحاضنة.

بعد ساعة واحدة ، أضف برفق أربعة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS على طول الجدار الجانبي للوحة ذات القاع الزجاجي ، وأعد الألواح إلى الحاضنة حتى تقييمها المجهري التالي. بعد تشريحها ووضعها داخل قطرات المصفوفة ، يجب أن يشبه مظهر الفحص DRG المضمن في المصفوفة الموضح هنا. لاحظ أن DRG ليست مستديرة تماما ، ولكنها تتمركز داخل قطرة المصفوفة ، مما يسمح بنمو الخلايا العصبية بزاوية 360 درجة.

مباشرة بعد الطلاء ، تشكل الخلايا السرطانية الحرشفية في الرأس والرقبة حلقة محيطية حول المصفوفة ، وتتوسع على طول الخلايا العصبية خلال اليومين إلى الثلاثة أيام القادمة. تنقسم الخلايا المطلية على قطرات تحكم فارغة تحتوي على مصفوفة وحدها بنشاط حول المصفوفات ، ولكنها لا تدخل أو تمتد فوق الأعلى. للقياس الكمي للغزو المحيط العصبي للخلايا السرطانية ، يتم تقسيم صور المقايسات إلى أربعة أرباع عبر خط رأسي واحد وخط أفقي واحد.

ثم يتم تسجيل سلسلة من النقاط لكل امتداد غزو حول العصب لوحظ في كل ربع ، مما يسمح بمقارنة نمو الخلايا السرطانية على طول الخلايا العصبية بين خطوط الخلايا السرطانية المختلفة. بمجرد إتقانها ، يمكن أن تكتمل تقنية عزل العقد الجذرية الظهرية في أقل من ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تقليل التعامل المفرط مع العقد الجذرية الظهرية لأن إصابة السحق هي السبب الأكثر شيوعا لفشل الفحص.

بعد هذا الإجراء ، يمكن دراسة آليات الغزو حول العصب ، مما قد يؤدي إلى تطوير علاجات مستهدفة ضد هذا النوع من غزو الأنسجة الرخوة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح العقد الجذرية الظهرية من الفأر وإعداد اختبار لفحص الغزو حول العصب.