زراعة انواع معينة ايليجانس في ثلاثة أبعاد في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع نظام زراعة ثلاثي الأبعاد للديدان الخيطية التي قد تحاكي الظروف الطبيعية بشكل أفضل. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطور C elegans وعلم وظائف الأعضاء والسلوك. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا ندرس سلوك الديدان الخيطية الطبيعية في الفاكهة المتعفنة وهي بيئة ثلاثية الأبعاد.

هذه التقنية هي ميزة مقارنة بتقنيات الزراعة ثنائية الأبعاد القياسية لأن الديدان الخيطية موجودة في موائل ثلاثية الأبعاد في الطبيعة. على الرغم من تطوير هذه الطريقة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الديدان الخيطية الأخرى. سيوضح هذا الإجراء تونغ يونغ لي ، طالب دراسات عليا في مختبري.

لبدء هذا الإجراء ، قام Otto Clave بالمحاليل المحضرة عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد 50 مل من محلول الكوليسترول المعقم بمعدل 5 ملليغرام لكل ملليلتر. في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، أضف 0.25 جرام من الكوليسترول و 50 ملليلترا من 99.99٪ من الإيثانول واخلطه جيدا.

بعد ذلك ، قم بتعقيم محلول الكوليسترول باستخدام حقنة سعة 50 مليلتر مع فلتر حقنة 0.45 تهوية وقم بإزالة أي كوليسترول غير متطور. ثم قم بتلقيح 10 مل من مرق lysogeny بالبكتيريا. استزراع التلقيح البكتيري عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزازية طوال الليل.

استعدادا للتخفيف التسلسلي ، خصص تسعة ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم في سبعة أنابيب مخروطية معقمة سعة 15 مل. لعمل خيمة من التخفيف السابع للطاف من Opi 50 Strain E Coli. بعد ذلك ، قم بإخراج مليلتر واحد من المزرعة البكتيرية أو المزرعة البكتيرية المخففة في أنبوب جديد به تسعة ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم.

ودوامة الخليط جيدا. بعد تحضير المزرعة البكتيرية ، أضف 0.6 جرام من كلوريد الصوديوم ، وجرام واحد من المثقاب المحبب و 0.5 جرام من البيبتون في قارورة سعة 500 مل. ضع قضيب تحريك مغناطيسي في القارورة.

ثم أضف 195 مل من الماء المقطر وقم بتغطية القارورة بورق الألمنيوم. بعد ذلك ، قام أوتو بتنظيف العينة عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، ضعي قارورة أوتو كلافيد الساخنة في طبق التحريك ، وقلبي بسرعة معتدلة لمدة ساعتين على الأقل حتى تصل درجة حرارتها إلى 40 درجة مئوية.

بدلا من ذلك ، يمكن تبريد القارورة إلى 40 درجة مئوية عن طريق وضعها في حمام مائي 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل نقلها على طبق التحريك. تأكد من أن تبرد بدرجة كافية للاستمرار من هنا. قد تؤدي درجة الحرارة المرتفعة إلى تعتيم المثقاب النهائي ولكن درجة الحرارة المنخفضة جدا قد تؤدي إلى تصلب المثقاب قبل الأوان.

عندما تصل درجة حرارة وسط المثقاب إلى 40 درجة مئوية ، أضف كلوريد الكالسيوم ومحلول الكوليسترول وكبريتات المغنيسيوم ومخزن فوسفات البوتاسيوم واستمر في تحريك المحلول. لاختبار عمر NGT-3D ، أضف 80 ميكرولترا من FUDR 150 ملم إلى الوسائط للحصول على تركيز نهائي يبلغ 120 ميكرومولار. بعد ذلك ، قم بإزالة ستة ملليلتر من وسائط المثقاب في أنبوب مخروطي معقم واحتفظ به دافئا في حاضنة.

سيتم استخدام هذه الوسائط للطبقة العليا الخالية من البكتيريا. بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من ثقافة البكتيريا المخففة في القارورة مباشرة على مقعد معقم. بالنسبة إلى NGT-3D ، صب 6.5 مل من الوسائط في أنابيب اختبار بلاستيكية شفافة سعة ثمانية ملليلتر لتشكيل طبقة مثقاب بكتيريا.

وقم بتوزيع 200 لتر ميكرو من الوسائط الخالية من البكتيريا بعناية فوق الوسائط ثلاثية الأبعاد شبه الصلبة لعمل طبقة رقيقة خالية من البكتيريا في الأعلى. ثم أغلق غطاء الغرفة بإحكام. بالنسبة إلى NGB-3D ، صب 65 مل من الوسائط في زجاجة ثقافة الخلايا البلاستيكية الشفافة بحجم 25 سم مربع.

ثم ضع الغرفة عموديا في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد للسماح للمستعمرات البكتيرية بالنمو إلى حجم كبير لا يقل قطره عن ملليمتر واحد. في هذا الإجراء ، اختر دودة L رباعية المراحل وانقلها إلى لوحة NGM خالية من البكتيريا. ثم اسمح للدودة بالتحرك بحرية لبضع دقائق لإزالة البكتيريا من جسمها.

وكرر الإجراء مرتين أخريين. بعد ذلك ، ضع الدودة النظيفة بعناية على سطح الوسائط ثلاثية الأبعاد. كان يجب أن تدخل الدودة بالفعل المثقاب في مصفوفة المثقاب ثلاثية الأبعاد.

ثم أغلق الغطاء بشكل غير محكم لاحتضانه لمدة 96 ساعة عند 20 درجة مئوية. بعد أربعة أيام ، أغلق الغطاء بإحكام وضع غرفة الثقافة NGT-3D في حمام مائي عند 88 درجة مئوية لإذابة المثقاب. باستخدام ماصة زجاجية ، انقل الوسائط المذابة إلى طبق بتري بلاستيكي يبلغ طوله تسعة سنتيمترات.

بعد ذلك ، باستخدام مجهر تشريح ستيريو الإرسال ، احسب عدد الديدان في مراحل L3 و L4 والبالغين. كما هو موضح هنا ، فإن بناء NGT-3D هو بروتوكول بسيط ومباشر ينتج عنه أنبوب اختبار مملوء بالمثقاب مع مستعمرات بكتيرية صغيرة متباعدة في جميع أنحاء المثقاب. لتأكيد ما إذا كانت C ايليجانس يمكن أن تقلل وتنمو بشكل طبيعي في NGT-3D ، تتم مقارنة الخصوبة وتطور اليرقات في 3D مع لوحات NGM القياسية 2D.

في مقايسة حجم الحضنة النسبية ، تم تكاثر خنثى C elegans البالغة في NGT-3D تماما مثل خنثى في ألواح MGM القياسية 2D عندما تكون المستعمرات البكتيرية وفيرة مع 60 مستعمرة على الأقل. علاوة على ذلك ، يستمر نمو اليرقة في NGT-3D أيضا بشكل طبيعي عندما يكون هناك الكثير من المستعمرات البكتيرية مع غالبية الديدان في حالة البالغين بعد 96 ساعة. ومع ذلك ، إذا كانت المستعمرات البكتيرية متناثرة في المصفوفة ثلاثية الأبعاد ، فإن كل من حجم الحضنة النسبي وتطور اليرقة يتأثر سلبا.

فيما يلي منحنى البقاء على قيد الحياة من النوع C البري في لوحات NGT-3D أو NGM. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات العمر الافتراضي وتحليل السلوك من أجل الإجابة على أسئلة حول الشيخوخة والسلوك في 3D.

بعد تطويرها ، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجالات علم الوراثة لاستكشاف أسئلة حول البيئة والتطور في C elegans. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الديدان الخيطية في بيئة مختبرية ثلاثية الأبعاد.