خلية خالية من الحمض النووي تحليل النزاهة في عينات البول

الهدف العام من هذه الطريقة هو تقييم سلامة الحمض النووي الخالي من خلايا البول في تسلسلات جينية مسرطنة محددة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال سرطان المسالك البولية ، مثل التشخيص المبكر غير الجراحي لسرطان المثانة والبروستاتا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة القيام بها وتحليلها.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تشخيص الأورام الخبيثة في المسالك البولية ، لأنها تطلق عادة الخلايا والأحماض النووية الحرة في البول. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على عينات المسالك البولية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل المصل أو البلازما. بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تركيز الحمض النووي الخالي من خلايا البول غالبا ما يكون منخفضا.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حاولنا إيجاد طريقة بسيطة للكشف المبكر غير الجراحي عن سرطان المثانة. لبدء الإجراء ، احصل على عينة بول نظيفة سعة 50 مليلتر في الصباح الأول تم تخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة لا تزيد عن ثلاث ساعات. اقلب العينة مرتين ثم قسم العينة إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 ملليلترا.

الطرد المركزي للعينة عند 850 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، لكل أنبوب ، قم بنقل 10 ملليلتر من الجزء العلوي من المادة الطافية إلى أنبوبين سعة خمسة ملليلتر ، مع ترك ما لا يقل عن ملليلترين من المادة الطافية فوق الحبيبات. تخلص من الكريات وقم بتخزين المادة الطافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

كرر هذه العملية للحصول على عينات بول إضافية حسب الحاجة. لبدء تنقية الحمض النووي ، قم بإذابة كمية من طاف البول لكل عينة. دوامة العينة المذابة وقلب الأنبوب مرتين.

ضع ملليلتر واحد من العينة في أنبوب سعة خمسة ملليلتر، وقم بتخزين الباقي عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد مجموعة تنقية الحمض النووي المناسبة لعينات البول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 100 ميكرولتر من البروتيناز K ومليلتر واحد من محلول التحلل إلى العينة واخلطهم جيدا باستخدام ماصة.

احتضان العينة عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد مخازن الغسيل في عمود دوران. بعد الحضانة ، اترك العينة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ثم أضف ملليلترا واحدا من الإيثانول المطلق واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات.

انقل 650 ميكرولتر من العينة إلى العمود. جهاز طرد مركزي عند 6000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. استبدل أنبوب التجميع وكرر هذه العملية حتى يتم تحميل كل العينة على العمود.

ثم أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الأول وقم بالطرد المركزي للعمود عند 6000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. استبدل أنبوب التجميع ، وأضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني ، وقم بالطرد المركزي للعمود بأقصى سرعة لمدة ثلاث دقائق. ضع العمود في أنبوب تجميع نظيف وجهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة ثلاث دقائق أخرى لإزالة المخزن المؤقت للغسيل المتبقي.

انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 ملليلتر. قم بتحميل 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف على العمود واترك المخزن المؤقت يمتص في العمود لمدة سبع دقائق. ثم الطرد المركزي للعمود عند 6000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

قم بإزالة الشفط مرة أخرى في العمود وقم بالطرد المركزي للعمود بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة للحصول على الحمض النووي الخالي من خلايا البول. لبدء إعداد المعايير ، قم أولا بعزل الحمض النووي من خط خلية مناسب باستخدام مجموعة تنقية. حدد كمية الحمض النووي من كل عينة بول منقاة في خط الخلية باستخدام مقياس الطيف الضوئي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة.

قم بتخفيف الحمض النووي ل UCF إلى نانوجرام واحد لكل ميكرولتر وتخزين العينات المخففة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لاختبار السلامة. قم بتخفيف الحمض النووي لخط الخلية لإنشاء ستة ، 100 ميكرولتر معايير بتركيزات مختلفة. قم بتخزين المعايير عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

لبدء اختبار سلامة الحمض النووي ، قم بإذابة عينات الحمض النووي UCF ، والمعايير ، والبادئات المناسبة ل PCR ، ومزيج أخضر فائق المزيج على الجليد. ثم قم بإعداد لوحة القرص الدوار المكونة من 72 بئرا بأنابيب شريطية. ضع اثنين ، 10 ميكرولتر من الحصص القياسية ثم كل عينة في الآبار.

قم بإعداد بئرين من الماء الخالي من RNase سعة 10 ميكرولتر كأدوات تحكم سلبية. لكل بئر مملوء ، قم بإعداد مزيج من ميكرولتر واحد من كل برايمر ، و 12.5 ميكرولتر من السوبرميكس الأخضر ، و 6.5 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. انقل 15 ميكرولترا من المزيج إلى كل بئر مملوء ، ثم انقل الآبار إلى قرص دوار سعة 72 بئرا.

قم بإجراء PCR باستخدام أداة في الوقت الفعلي وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. باستخدام برنامج الأداة ، تحقق مما إذا كانت أي نسخ مكررة لها فرق في قيمة عتبة التدوير بمقدار واحد أو أكثر. تجاهل تلك العينات من التحليل وقم بتقييم متوسط عتبة ركوب الدراجات للعينات المتبقية.

قم بإجراء تحليل الذوبان على كل عينة بقيمة عتبة دورة متوسطة تبلغ 36 أو أقل لتقييم خصوصية منتج PCR. ثم استخدم المنحنى القياسي لتحديد التركيز بالنانوجرام لكل ميكرولتر لكل زين. تم عزل الحمض النووي الخالي من خلايا البول وتم تقييم سلامة الحمض النووي في أربع مناطق تظهر زيادة في عدد نسخ الحمض النووي في الأورام الصلبة.

كما تم تقييم تسلسل التحكم للتحقق من أن كمية الحمض النووي في كل عينة كانت كافية لاختبار السلامة. تم حساب إجمالي تركيز الحمض النووي الحر ومعاملات التباين لكل جين. تظهر هذه الطريقة حساسية 73٪ و 84٪ خصوصية للكشف عن سرطان المثانة ، ولكن فقط 58٪ حساسية و 44٪ خصوصية لسرطان البروستاتا.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في يوم عمل واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي أو تسلسل الجيل التالي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل محفز رقم النسخ للجينات ذات الاهتمام. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الحمض النووي الخالي من الخلايا عن البول بطريقة بسيطة للغاية ، وكيفية دراسة سلامة مناطق معينة ذات أهمية باستخدام مناهج تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.