والسريعة، طريقة قابلة للعزل، دراسة وظيفية، وتحليل المصفوفة خارج الخلية المشتقة من خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل المصفوفة خارج الخلية عن الخلايا المستنبتة لمجموعة متنوعة من التجارب النهائية ، للمساعدة في فهم وظائف وخصائص المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة الطبيعية وعمليات المرض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المصفوفة خارج الخلية ، مثل التنظيم أو التركيب الجزيئي أو تفاعلات البروتين أو الخصائص الوظيفية للمصفوفة خارج الخلية. أيضا يمكن تحضير المصفوفة خارج الخلية من أي نوع من الخلايا الملتصقة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها بمقاييس مختلفة لإزالة الخلايا بكفاءة والاحتفاظ ببروتينات المصفوفة خارج الخلية. ستظهر الإجراء سيلفيا روزيني ، طالبة الدراسات العليا في مختبري ، وأندرو هيلويل باحث ما بعد الدكتوراه. للبدء ، تنزلق الخلايا الصفيحية على الغطاء لتصوير الخلايا الحية والمصفوفة خارج الخلية أو ECM.

لدراسات الفحص المجهري للزهار ، يتم تثبيت ECM. أو لإعداد ECM المشتق من الخلايا للدراسات الوظيفية على نطاق صغير. احتضان الخلايا في درجة حرارة ورطوبة مناسبتين لوقت مناسب للخلايا لإيداع ECM.

عادة ما تكون أكثر من 16 ساعة. في شفاط المستخرج ، قم بإعداد 20 مللي مولار من هيدروكسيد الأمونيوم في وعاء مناسب باستخدام الماء منزوع الأيونات لتخفيف محلول المخزون من واحد إلى 14. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وإزالة وسط الثقافة برفق.

ثم أضف PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم عن طريق سكبه برفق على جدار الطبق. هز الطبق مرتين واسكب السائل. ثم كرر الغسيل مرتين أخريين.

في غطاء الشفاط ، قم بإزالة آخر غسول PBS ، وأضف 1.5 مل من هيدروكسيد الأمونيوم لكل طبق 60 ملم ، واحتضن الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. حرك الأطباق برفق كل دقيقة لضمان تحلل جميع الخلايا. بعد ذلك ، أضف كميات وفيرة من الماء منزوع الأيونات إلى كل طبق وهز الطبق.

ثم اسكب المادة القابلة للذوبان بهيدروكسيد الأمونيوم ، والتي تتكون من هيدروكسيد الأمونيوم والخلايا المحللة والمياه منزوعة الأيونات. اغسل طبقة ECM غير القابلة للذوبان بكميات وفيرة من الماء منزوع الأيونات أربع مرات أخرى ، لضمان الإزالة الكاملة لجميع المواد القابلة للذوبان بهيدروكسيد الأمونيوم. من الضروري إزالة الخلايا بالكامل بغسلات غزيرة في الماء منزوع الأيونات.

إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوات بشكل كاف ، فقد تبقى المواد الخلوية على الطبق وتلوث التحليل النهائي. لفحص ECM عن طريق التألق المناعي ، قم بإزالة الماء منزوع الأيونات المتبقي ، وقم بإصلاح ECM بإضافة 2٪ بارافورمالدهيد ، واختصار PFA ، واحتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استخدم PBS لغسل كل عينة إصلاح مرتين ، وتخلص من المحلول في حاوية نفايات سائلة قبل إجراء الفحص المجهري الفلوري وفقا لبروتوكول النص.

في غطاء التدفق الصفحي ، قم بإعداد محاليل معقمة من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، وهيدروكسيد الأمونيوم 20 ملليمولار ، والماء منزوع الأيونات عن طريق تمرير كل محلول عبر مرشح معقم 0.2 ميكرومتر في حاوية معقمة مناسبة. مع الحفاظ على تقنية المعقمة ، استخدم PBS المعقم لغسل خلايا منتج المصفوفة برفق على زلات الغطاء ثلاث مرات. بعد إزالة غسل PBS النهائي ، أضف 1.5 مل من هيدروكسيد الأمونيوم المعقم إلى الطبق 60 ملم واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق مع التأرجح المتقطع.

أضف كميات وفيرة من الماء المعقم منزوع الأيونات إلى الطبق مع التأرجح ، واسكب محللة الخلية في حاوية نفايات مناسبة. كرر هذا الغسيل أربع مرات أخرى لضمان الإزالة الكاملة للمادة القابلة للذوبان. بعد التربسين والتكوير للخلايا وفقا لبروتوكول النص ، أعد تعليق خلايا الاختبار في وسط معقم جديد ، واستخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا.

ثم قم بوضع العدد المناسب من خلايا الاختبار ووسط الثقافة على ECM المعزول المعقم على زلات الغطاء واحتضانه لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات أو للوقت المطلوب. لفحص تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين ، قم بإصلاح خلايا الاختبار في 2٪ PFA وتلطيخها ب FITC-Phalloidin لتصور F-actin ، و DAPI لتصور النوى. بعد زراعة عدد كبير من الخلايا ، ثم إزالة الخلايا وغسل ECM كما هو موضح سابقا في الفيديو ، قم بإمالة كل لوحة بزاوية لتصريف المياه المتبقية إلى قاع الطبق واستخدم ماصة P200 لإزالة أي ماء متبقي بعناية حتى تجف اللوحة تماما.

في الوقت نفسه ، قم بتسخين عينة SDS-PAGE التي تحتوي على 100 ملليمولار DDT إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، وأضف 200 ميكرولتر إلى كل لوحة 100 ملم ليتم فحصها بواسطة اللطخة المناعية. استخدم مكشطة خلوية لتجميع العينة على جانب واحد من الطبق ، واستخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لنقلها إلى أنبوب. لتحليل ECM عن طريق قياس الطيف الكتلي ، قم بإعداد عينة أكثر تركيزا عن طريق جمع المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE من الطبق ، وإعادة تسخينه إلى 95 درجة مئوية ، واستخدام نفس الكمية عبر لوحين إلى ثلاثة ألواح إضافية.

انقل أي مستخلص عازل لعينة SDS-PAGE المتبقية من طرف مكشطة الخلية إلى الأنبوب لتقليل فقد مادة ECM. من أجل الاستخراج الفعال ل ECM المعزول في المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE ، من الضروري تسخين المخزن المؤقت للعينة إلى 95 درجة ، ويحتوي على عامل اختزال ، وأن يتم كشط اللوحة على نطاق واسع. تظهر هنا خلايا COS-7 المزروعة على زلات غطاء زجاجي.

أزال العلاج بهيدروكسيد الأمونيوم الخلايا بشكل فعال كما هو موضح من خلال فقدان نوى الخلية والهيكل الخلوي للأكتين. في هذا الشكل ، تم نقل خلايا COS-7 باستخدام علامة RFP thrombospondin-1. وتم تصور ECM قبل وبعد معالجة هيدروكسيد الأمونيوم.

يتم الاستدلال على أن النقطة الفلورية المحددة في كلتا الصورتين مرتبطة ب ECM. في هذه التجربة ، تمت إزالة الخلايا الليفية الجلدية البشرية باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم وتم فحص ECM بجسم مضاد مضاد للكولاجين 1 ، والذي أظهر نمط تلطيخ شظوي وشبكي مميز. كما هو موضح هنا ، تم إجراء تلطيخ الفيبرونيكتين على ECM من خلايا الساركوما الغضروفية المستخرجة من هيدروكسيد الأمونيوم.

في هذا المثال ، تم طلاء خلايا اختبار COS-7 لمدة ساعتين على ECM معقم تنتجه خلايا RCS وتم تحليلها لتنظيم F-actin بواسطة تلطيخ FITC-Phalloidin. بالمقارنة مع خلايا COS-7 التي تنتج ECM الخاصة بها. في هذه التجربة ، تم عزل ECM من خلايا الساركوما الغضروفية للفئران ثم تم فصل البروتينات المشتقة من ECM بواسطة SDS-PAGE.

وتم عزل العصابات الأربعة الرئيسية وتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي. تم تحديد فيبرونكتين ، ثرومبوسبوندين -1 وخمسة ، وماتريلين -1. أخيرا ، تم تحليل ECM الذاتي للأرومات الليفية الجلدية البشرية عن طريق النشاف المناعي.

تم الكشف عن الفيبرونيكتين والثرومبوسبوندين -1 ، في حين كانت البروتينات داخل الخلايا ألفا توبولين وبيتا أكتين غائبة. بمجرد إتقانها ، يمكن إزالة الخلايا بهيدروكسيد الأمونيوم واستخراج ECM باستخدام عينة SDS-PAGE الساخنة من ثلاثة أطباق 100 ملم في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر صنع محاليل هيدروكسيد الأمونيوم الطازجة في كل مرة لإزالة الخلايا.

من المهم أيضا استخدام غسالات غزيرة بالماء منزوع الأيونات للتأكد من إزالة جميع الخلايا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق مثل تحليل البروتينات ل ECM المستخرج من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الوفرة النسبية لبروتينات ECM التي تنتجها أنواع مختلفة من الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إزالة الخلايا بكفاءة من أطباق زراعة الخلايا وكيفية استخراج ECM.

لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء الشفاط وارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.