Cryosectioning المناطق المتاخمة من العضلات الهيكلية واحدة فأرة للالتعبير الجيني والتحليلات النسيجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين تحليل المعلمات النسيجية والجزيئية من الأقسام المجاورة لنسيج واحد. بهذه الطريقة ، يمكننا المساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا العضلات الهيكلية وأمراضها. مثل ، ما هي التأثيرات التجديدية بعد إصابة العضلات ، وما هي آثار توصيل الجينات الفيروسية عن طريق الحقن العضلي؟

تتمثل ميزة هذه الطريقة في أن البيانات النسيجية والجزيئية يمكن أن ترتبط ارتباطا مباشرا بنسيج واحد. هذا يجعل تحليل البيانات أكثر فعالية واستخداما أفضل للأنسجة التجريبية. قبل خمس دقائق من الانتهاء من التشريح ، قم بتبريد حمام الحفظ بالتبريد.

عندما تكون عينات الأنسجة جاهزة للتضمين ، قم أولا بتطبيق راتنج التضمين على الثلث السفلي إلى النصف من الأنسجة ، حيث تلتقي العضلة بالفلين. يجب أن يتم ذلك بدقة لتقليل تداخل الراتنج مع خطوات المصب. بعد ذلك ، قم بإسقاط الفلين على الفور في حمام 2-ميثيل بوتان المبرد إلى سالب 140 درجة مئوية.

قم بتضمين ما يصل إلى ثمانية مستحضرات للأنسجة لكل دفعة. في الحمام ، حرك المناديل لمدة 30 ثانية ، وكشط الجزء السفلي من الدورق لمنع فلين الأنسجة من التجمد في المحلول. بعد 30 ثانية ، باستخدام أداة معدنية ، اسحب فلينا من 2-ميثيل بوتان.

بعد ذلك ، قم بإزالة زلة الغطاء الداعمة بسرعة. ربت على 2-Methylbutane الزائد مرة أخرى في الحمام ، ثم قم بإسقاط الفلين الأنسجيالي في حمام النيتروجين الخارجي. بعد نقل جميع الأنسجة إلى النيتروجين السائل ، انقلها إلى وعاء وخزنها عند سالب 80 درجة مئوية.

بعد تحضير ناظم البرد وتركيب عينة من الأنسجة ، استخدم أدوات التحكم الخشنة والدقيقة لدفع العينة إلى الشفرة بحيث تلامس الشفرة. أعد تعيين مجموع سماكة المقطع إلى الصفر في هذه المرحلة. بعد ذلك ، اضبط ناظم البرد على وظيفة القطع بسماكة القسم عند 30 ميكرون.

وقص وتجاهل الأقسام حتى عمق الأنسجة المطلوب. لجمع القطع بالتبريد بكفاءة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، افتح أولا أنبوب التجميع وضعه بالقرب من حامل الشفرة. هناك ، استخدم فرشاة نظيفة ومبردة مسبقا لالتقاط كل قسم ونقله إلى الأنبوب.

ما ينتج عن الأقسام الأمامية لظنبوب الفأر المجمعة 30 ميكرون المأخوذة من عمق الأنسجة 400 إلى 4 000 ميكرون 25 إلى 50 ملليغرام من العضلات. إذا كان الراتنج المدمج يحيط بالقطع بالتبريد ، فقم بقفل فرامل اليد واستخدم شفرة حلاقة لحلق قطع صغيرة من الراتنج حتى لا تكون هناك سوى طبقة رقيقة حول الجزء العلوي من العضلات. قم دائما بقص الراتنج مع الشفرة بزاوية بعيدا عن العضلات.

لا تضعف الطبقة الرقيقة من راتنج التضمين بشكل كبير استخراج الحمض النووي الريبي في اتجاه مجرى النهر. في حالة وجود راتنج تضمين أكثر سمكا ، استخدم الفرش لإبعاده عن العضلات قبل نقل القطع بالتبريد إلى أنبوب التجميع. أثناء عملية التقسيم ، عندما تكون الأقسام النسيجية مطلوبة ، أعد ضبط سمك الشريحة إلى سبعة ميكرون باستخدام أدوات التحكم في البرد.

بعد ذلك ، قم بقص وتجاهل أربعة إلى سبعة أقسام للحصول على سطح نسيج متسق ومتساوي وتدوين عمق هذا الأنسجة. الآن ، قم بقص قسم جيد وتوجيهه على سطح حامل الشفرة. باستخدام شريحة مجهر بدرجة حرارة الغرفة ، التقط القسم وأعد الشريحة إلى درجة حرارة الغرفة.

اجمع كل الأقسام المطلوبة ثم قم بتدوين عمق الأنسجة النهائي. بعد الانتهاء من التقسيم ، قم بتسجيل وزن الأقسام المبردة المجمعة بسرعة لعزل الحمض النووي الريبي. أعد الأنبوب على الفور إلى غرفة ناظم البرد للحفاظ على درجة حرارة الأقسام بالقرب من سالب 20 درجة مئوية.

ابدأ بنقل عمليات القطع بالتبريد المجمعة بسرعة إلى الثلج ، وإضافة ما يقرب من مليليتر واحد من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي العضوي لكل 50 ملليغرام من القطع بالتبريد. كلما تم تطبيق الكاشف مبكرا ، قل تحلل الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد بإبرة قياس 18 ، قم بتجانس عمليات القطع بالتبريد دون عمل الكثير من الفقاعات عن طريق رسم محلول بشكل متكرر ، وإخراجه على جدران الأنبوب.

استخدم طرف الإبرة لتفريق القطع المتكتلة. بعد كل خمس ضربات ، أعد العينة لفترة وجيزة إلى الجليد لإبقائها باردة. بمجرد تجانسها ، استخدم إبرة قياس 22 لترتريتري العينة بعناية باستخدام خمس ضربات أخرى.

ثم أعد العينة إلى الجليد. كرر هذه العملية ثلاث أو أربع مرات لتحقيق تجانس الأنسجة المشتتة بدقة. بمجرد إجراء التجانس النهائي ، اتركه يحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتعطيل المجمعات الجزيئية.

بعد ذلك ، في غطاء الدخان ، أضف 0.1 مليلتر من BCP لكل مليلتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي. ثم هز الأنبوب بقوة لمدة 15 ثانية. لا تستخدم دوامة.

ثم احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد الحضانة القصيرة ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 15 دقيقة عند 12 ، 000 جم وأربع درجات مئوية. ثم اجمع بعناية المرحلة العليا الصافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي.

انقله إلى أنبوب نظيف ، وأضف حجما متساويا من 70٪ من الإيثانول ، المكون في مياه البحر العميقة. بعد دوامة الأنبوب لفترة وجيزة ، اتركه يحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واستمر باتباع بروتوكول النص. تم إجراء مستحضرات الحمض النووي الريبي للعضلات الهيكلية من الظنبوب الأمامي للفأر.

قبل ثلاثة أيام ، تم حقن بعض العضلات ب 10 سموم قلبية ميكرومولار والبعض الآخر بالمحلول الملحي. كان نقاء وعائد الحمض النووي الريبي من هذه العينات ممتازا. كان عائد الحمض النووي الريبي أعلى بكثير في العضلات الأمامية للظنبوب بعد إصابة السموم.

يمكن أن تؤثر سلامة الأنسجة وإنتاج الحمض النووي الريبي في هذه الملاحظة. تم تقييم ثبات جودة الحمض النووي الريبي المحضر باستخدام ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي الذي تم تخزينه عند سالب 20 درجة مئوية لمدة 18 شهرا. لا تزال نطاقات الحمض النووي الريبي الريبوزومي البارزة 18S و 28S واضحة في العينات التي تظهر جودة الحمض النووي الريبي العالية.

تم تلطيخ أقسام من سبعة ميكرون للتعبير عن سلسلة الميوسين الجنينية الثقيلة ، التي شوهدت باللون الأحمر. للكشف عن الألياف المتجددة ، ملطخة بالكولاجين ستة ، تظهر باللون الأخضر ، والتي تحدد ألياف العضلات وملطخة باللون الأزرق لمراقبة النوى. عندما يكون هناك حقن سمين ضعيف ، تظهر الإصابة ضئيلة.

يؤدي الحقن الناجح للسموم إلى تأثر منطقة أكبر بكثير من حجرة العضلات المستهدفة. يمكن استخدام درجة الإصابة كمعايير إدراج لتحليل الحمض النووي الريبي. بمجرد إتقان ، يمكن إكمال أقسام القطع لاستخراج الحمض النووي الريبي والشريحة النسيجية في أقل من نصف ساعة لنسيج واحد.

بعد هذا الإجراء ، يمكن اتباع بقع الفلورسنت المناعي النسيجية الأخرى للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة. يمكن أيضا استخدام عمليات القطع بالتبريد المجمعة لجمع الحمض النووي أو البروتين.