استخدام تقنية تراكب لينة أجار للكشف عن المركبات المثبطة إنتاج البكتريا

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص العوامل التي تنتجها سلالة بكتيرية واحدة ، والتي تثبط السلالة البكتيرية الثانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في عدد من المجالات الميكروبيولوجية ، ولكنها مفيدة بشكل خاص في البيئة الميكروبية ، في فهم التفاعلات البكتيرية العدائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير مكلفة وسهلة الأداء والتفسير.

ستظهر الإجراء أريثا ، وهي طالبة في المختبر. لبدء التجربة ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من P syringae في 3 ملليلتر من مرق King's Medium B ، أو KB. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف ثقافة المرق من 1 إلى 100 إلى 3 ملليلتر من مرق KB الطازج.

احتضان الثقافة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات مع الرج في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن الثقافة لديها زيادة ملحوظة في التعكر ، ثم أضف Mitomycin C.Next ، احتضان الثقافة طوال الليل مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، حبيبات من واحد إلى ملليلتر من المزارع المستحثة عن الميتومايسين سي في جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء.

قم بإزالة وتعقيم المواد الطافية المزرعة عن طريق تمرير المادة الطافية عبر مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. أضف كلوريد الصوديوم للوصول إلى تركيز مولي واحد ، وأضف البولي إيثيلين جلايكول ، أو PEG 8000 ، إلى التركيز النهائي بنسبة 10٪ ، إلى المادة الطافية المعقمة. اقلب العينات بشكل متكرر حتى يذوب كل من كلوريد الصوديوم و PEG تماما.

احتضان العينات في حمام جليدي لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات. بعد الغزل ، قم بصب المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت عن طريق سحب العينات بشكل متكرر.

قم بإزالة PEG المتبقي عن طريق استخراجين متتابعين بحجم متساو من الكلوروفورم. يمزج مع الكلوروفورم مع الحبيبات المعاد تعليقها ودوامة الخليط لمدة 15 ثانية. ثم الطرد المركزي الخليط على حرارة 20 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق.

انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب ميكرو فيوج جديد. كرر هذا الاستخراج مرتين ، حتى لا تظهر واجهة بيضاء بين المرحلة المائية والعضوية. اسمح للكلوروفورم المتبقي بالتبخر من المواد الطافية المستخرجة في غطاء الدخان.

بتلقيح مستعمرة واحدة من سلالة P syringae إلى ثلاثة ملليلتر من KB ، واحتضان الثقافة طوال الليل مع الرج في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة من 1 إلى 100 إلى كيلوبايت جديد. احتضان الثقافة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات مع الرج في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد أجار الماء المعقم عن طريق تعقيم تعليق أجار في ماء فائق النقاء.

حافظ على الأجار الناعم المنصهر في حمام مائي 60 درجة مئوية قبل الاستخدام. باستخدام ماصة مصلية معقمة، انقل ثلاثة ملليلتر من الأجار الناعم إلى أنبوب استزراع معقم. أعد أنبوب الثقافة إلى الحمام المائي للحفاظ عليه في حالة منصهرة.

قبل صب التراكب ، اترك الأجار المنصهر يبرد ، لكن لا تدعه يتصلب. من الأهمية بمكان أن يتم الحفاظ على الأجار في حالة ساخنة ومنصهرة تماما قبل التلقيح. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسيكون للتراكب مظهر محبب وسيكون من الصعب تفسيره.

في غطاء معقم ، قم بتلقيح 100 ميكرولتر من ثقافة سلالة الاختبار في الأجار الناعم والدوامة للخلط. قم بتدوير المزرعة يدويا لمدة 10 إلى 15 ثانية ، ثم اسكبها في قاع طبق أجار. قم بإمالة اللوحة في جميع الاتجاهات للتأكد من أن الأجار الناعم يغطي أجار السفلي بالتساوي.

غطي الطبق واتركيه لمدة 20 إلى 30 دقيقة حتى يتصلب. احرص على عدم إزعاج اللوحة أثناء التصلب. بمجرد التصلب ، ضع ليلترين إلى خمسة ميكرولتر من المادة الطافية على التراكب.

اترك الأطباق تحتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. راقب النتائج وسجلها في صباح اليوم التالي. باستخدام هذه الطريقة ، يتم تثبيط سلالتين من P syringae بواسطة بكتيريا مختلفة.

السلالة أ حساسة للبكتيريا عالية الوزن الجزيئي تايلوكين ، ولكنها ليست حساسة للبكتيريوسين البديل منخفض الوزن الجزيئي. على العكس من ذلك ، فإن السلالة B غير حساسة للتايلوكين ، ولكنها حساسة للبكتيريوسين منخفض الوزن الجزيئي. يتم استرداد Tailocin بكفاءة بعد هطول الأمطار PEG ، في حين أن البكتيريا ذات الوزن الجزيئي المنخفض ليست كذلك.

يتميز القتل بوساطة العاثيات عن غيرها من مضادات الميكروبات غير القابلة للتكرار من خلال مقارنة سلسلة التخفيف. في حالة التطهير بوساطة العاثيات ، تم حل تخفيف المادة الطافية إلى لويحات فردية ، أو مناطق تطهير ، بينما لم يتم حل التطهير بوساطة البكتيريوسين في مثل هذه اللويحات. يمكن استخدام هذا الإجراء كشاشة أولية لتحديد العوامل المثبطة ، ويمكن دمجه مع التلاعب الجيني النهائي لتحديد أو تأكيد مصدر هذا النشاط.