رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف تفاعلات الجزيئات الصغيرة للحمض النووي ، بما في ذلك رسم خرائط موقع الربط ، باستخدام الرحلان الحراري المجهري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول معلمات الربط الأساسية للتفاعلات الجزيئية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مستقلة عن حجم شريك التفاعل ، مما يسمح بالحصول على بيانات مراقبة الجودة للتفاعلات الصعبة بين الأبتامير والجزيئات الصغيرة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعلات الجزيئات الصغيرة أبتامر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التفاعلات الجزيئية الأخرى مثل تفاعلات الدواء المستهدف أو المستضد / الأجسام المضادة. لبدء الإجراء ، قم بإعداد محلول مخزون 100 ميكرومولار من Cy5 المسمى DNA DH25.42 aptamer في الماء المقطر. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول مخزون أبتامر إلى 200 نانومولار مع مخزن مؤقت ملزم.

احتضان محلول عمل أبتامر لمدة دقيقتين عند 90 درجة مئوية. قم بتبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة على الجليد. بعد ذلك ، قم بتسمية ووضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الربط سعة 200 ميكرولتر لتخفيف تسلسلي من 16 خطوة للرابط المراد اختباره.

ماصة 20 ميكرولتر من محلول مخزون 10 ملليمولار من الترابط ومخزن مؤقت ملزم في الأنبوب 1. الماصة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم في الأنابيب من 2 إلى 16. ثم انقل 10 ميكرولترات من مخزون الترابط من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2 واخلطه جيدا مع الماصة.

انقلي 10 ميكرولتر من الخليط المخفف إلى الأنبوب 3 واخلطيهم جيدا. استمر في التخفيف التسلسلي بهذه الطريقة ، وقم بتصحيح تأثيرات التخفيف المؤقت إذا لزم الأمر ، وتخلص من 10 ميكرولتر الزائدة من الأنبوب 16 عند الانتهاء. أضف 10 ميكرولترات من محلول عمل أبتامر إلى كل عملية تخفيف واخلطها جيدا مع الماصة.

احتضان العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ارسم كل خليط في شعرية قياسية نظيفة ، مع التأكد من لمس الشعيرات الدموية فقط في النهايات. ضع الشعيرات الدموية في حامل الدرج بترتيب تنازلي للتركيز.

ابدأ تشغيل جهاز MST وافتح برنامج التحكم في الأجهزة. قم بتمكين التحكم اليدوي في درجة الحرارة واضبط درجة حرارة الجهاز على 25 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح الأداة في درجة الحرارة الصحيحة ، أدخل الدرج الشعري.

اضبط قناة LED على اللون الأحمر ل Cy5 المسمى aptamer. اضبط طاقة LED للحصول على إشارة مضان تبلغ 500 وحدة. ثم قم بإجراء فحص الشعيرات الدموية للحصول على المواضع الشعرية والتحقق من جودة العينة.

إذا كانت القمم الناتجة على شكل حرف U أو مسطحة ، فقم بإعداد عينات جديدة في الشعيرات الدموية المشفرة لتقليل تأثيرات الالتصاق. في برنامج أداة MST ، املأ تركيز الترابط ونوع التخفيف للشعيرات الدموية الأولى. انقر واسحب لملء التركيزات والتخفيفات للشعيرات الدموية المتبقية.

أدخل تركيز الأبتامر في المزيج النهائي. تأكد من ضبط طريقة التجربة لاكتشاف التألق لمدة خمس ثوان ، وتسجيل MST لمدة 30 ثانية ، ثم تسجيل التألق لمدة خمس ثوان بعد إيقاف تشغيل الليزر. اضبط طاقة الليزر على 20٪ اضبط مسار الملف واحفظ ملف التجربة.

ثم ابدأ قياس MST. احصل على ثلاثة قياسات على الأقل بهذه الطريقة. لبدء تحليل البيانات ، افتح برنامج تحليل MST وقم بتحميل ملف التجربة.

حدد MST لنوع التحليل. يسمح برنامج التحليل بمقارنة التكرارات الفنية حيث كانت جميع القياسات من نفس مجموعة الشعيرات الدموية. يمكن إضافة التكرارات البيولوجية من مجموعة مختلفة من الشعيرات الدموية إلى التحليل أيضا.

انقر فوق زر المعلومات أسفل القياس الأول. افحص آثار MST بحثا عن المطبات أو المسامير التي تشير إلى تأثيرات التجميع أو هطول الأمطار. ثم افحص المسح الشعري وتراكب الشكل الشعري بحثا عن قمم مسطحة أو على شكل حرف U تشير إلى تأثيرات الالتصاق أو الامتصاص.

نظرا لأن المجاميع وتأثيرات الامتصاص يمكن اكتشافها بسرعة في MST ، فإن الطريقة تسمح بالتحسين السريع والسريع للإعداد الفني لضمان جودة البيانات المثلى. تحقق من تأثيرات التبريد أو التحسين المعتمدة على الترابط في المسح الشعري والتألق الأولي. افحص التغير الفلوري بمرور الوقت بحثا عن علامات تبييض الصور أو تحسين الصورة.

بمجرد التحقق من جودة البيانات ، قم بالتبديل إلى وضع الاستجابة للجرعة. حدد إعداد تحليل الخبراء في استراتيجية تقييم T Jump MST. ثم حدد نموذج التل لتركيب المنحنى لحساب معلمات الربط تلقائيا.

في قائمة مقارنة النتائج، حدد نوع التسوية. تصدير البيانات التي تمت تسويتها كجدول بيانات أو ملف PDF. في هذا الإجراء ، تم استخدام MST للتحقيق في تفاعلات الربط لأبتامر الحمض النووي أحادي الخيط مع مجموعة مختارة من روابط الجزيئات الصغيرة.

كانت منحنيات MST متوافقة مع معادلة التل وتم تحديد قيم التركيز الفعالة للنصف الأقصى. في خمسة قياسات تكرار بيولوجية مستقلة للأبتامر مع ATP ، أظهر تفاعل أبتامر ATP سعة ربط سالبة من 6 إلى 13 وحدة ، ومتوسط قيمة EC50 تبلغ حوالي 52.3 ميكرومولار. تم تطبيع بيانات كل رابط إلى جزء من الجزيئات المرتبطة ثم مقارنتها.

تشير قيم EC50 ل ADP و AMP و SAM مقارنة ب ATP إلى أن عدد مجموعات الفوسفات له تأثير طفيف على الأكثر على سلوك ربط الأبتامر. أظهرت إزالة مجموعة hydroxal robo C2 أيضا تأثيرا طفيفا فقط على تقارب ربط الأبتامر. لم يرتبط الأبتامير في حالة عدم وجود مجموعة اقتران أو إذا تم تغيير مجموعة الاقتران إلى جوانين.

ارتبط الأبتامير بالأدينين وحده ، مما يشير أيضا إلى أن مجموعة الأدينين هي موقع الربط الرئيسي للأبتامر. بمجرد إتقانها ، يمكن أن توفر هذه التقنية معلومات أساسية حول معلمات الربط الأساسية في دقائق إلى ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.