Name: رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: استكشف تقنية الميكروسكيل ثيرموفوريسيس لتوصيف تفاعلات الأبتامرات مع الجزيئات الصغيرة ورسم مواقع الارتباط. تتيح هذه الطريقة تحديد معاملات الارتباط بدقة عالية في محلول.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب ليس لديهم الاعترافات.

1. إعداد المخزون العمل أبتمر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع إرشادات الشركة المصنعة وحل النوكليوتيد (5 Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3، سلسلة من مرجع 18) في الماء لتصل إلى تركيز النهائي 100 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل أبتمر العمل التي تمييع الأسهم النوكليوتيد إلى 200 نيوتن متر مع العازلة ملزمة (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.6، 300 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي MgCl 2، 0.01٪ Tween20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط لمدة 2 دقيقة عند 90 درجة مئوية، والسماح للعينة يبرد على الفور إلى أسفل على الجليد، واستخدام العينة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 2. إعداد والتخفيف سلسلة يجند <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل يجند (أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP)، أحادي فسفات الأدينوزين (AMP)، الأدينين، غوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP)، السيتوزين ثلاثي الفوسفات (CTP)، deoxyadenosine ثلاثي الفوسفات (dATP)، وميثيونين S-adenosyl (SAM) و 10 ملي الأسهم لكل منهما)، إعداد diluti مسلسل 16 خطوةعلى في 200 ميكرولتر أنابيب رد فعل الصغيرة. ملاحظة: الطرد المركزي من أسهم يجند لمدة 5 دقائق في 14000 x ج قد تساعد على إزالة الركام. ، ينصح انخفاض حجم منخفضة أنابيب رد فعل ملزم لتجنب امتصاص الجزيئات على الجدران أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء بأقصى تركيز لا يقل عن 50 مرات أعلى من النسب المقدرة والحد من تركيز يجند بنسبة 50٪ في كل خطوة التخفيف. ملاحظة: أداة تركيز مكتشف في تنفيذ البرامج السيطرة تحاكي ربط البيانات وتساعد في العثور على الحق في مجموعة تركيز لسلسلة التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 20 ميكرولتر من الأسهم يجند (10 ملم) في أنبوب 1. إضافة 10 ميكرولتر من أبتمر العازلة ملزمة في أنابيب رد فعل الصغرى 2-16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 ميكرولتر من أنبوب 1 إلى 2 أنبوب وتخلط بشكل صحيح من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب التالي وكرر هذا التخفيف لأنابيب المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الزيادة 10 ميكرولتر من الأنبوب الماضي. تجنب أي بuffer آثار التخفيف. يجب أن يكون المخزن المؤقت في أنبوب 1 وفي أنابيب 2-16 متطابقة. </li></ol> 3. إعداد مزيج رد الفعل النهائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ردود الفعل ملزمة الفردية مع حجم 20 ميكرولتر (10 ميكرولتر من أبتمر العمل الحل + 10 ميكرولتر من التخفيف يجند المعنية) للحد من الأخطاء pipetting ل. وبلغ حجم التداول ميكرولتر 4 فقط هو صوف فاي cient إلى الفرنسيسكان ليرة لبنانية الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من محلول العمل 200 نانومتر أبتمر إلى 10 ميكرولتر من كل تخفيف يجند وتخلط بشكل صحيح من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفاي ليرة لبنانية العينات في الشعيرات الدموية القياسية عن طريق غمس الشعيرات الدموية في العينة. قد تكون أوقات أطول الحضانة اللازمة لبعض التفاعلات. ومع ذلك، 5 دقائق كافية بالنسبة لمعظم. المس الشعيرات الدموية فقط على الجانبين، وليس على الجزء الأوسط، حيث سيتم اتخاذ القياس البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشعيرات الدموية على عشرالبريد علبة الشعرية وبدء تشغيل الجهاز MST. </li></ol> 4. بدء تشغيل جهاز MST ملاحظة: يوفر جهاز اثنين من حزم البرامج المثبتة مسبقا، و &#39;&#39; السيطرة &quot;برنامج لإعداد فني من الظروف التجريبية و &#39;&#39; تحليل&quot; برنامج لتفسير البيانات المنتجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل وضع علبة الشعرية في الجهاز MST، بدء برنامج حاسوبي لمراقبة وضبط درجة الحرارة المطلوبة الشاملة عن طريق اختيار &#39;&#39; تمكين اليدوية التحكم في درجة الحرارة &quot;في&quot; &quot;التحكم في درجة الحرارة&quot; القائمة المنسدلة. ضبط درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية في هذا الطريق. ملاحظة: وثائق MST يمكن أن يكون 22-45 درجة مئوية التحكم في درجة حرارته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لدرجة الحرارة للوصول إلى المستوى المتوقع ومن ثم وضع علبة الشعرية في الجهاز MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين القناة أدى إلى &#39;&#39; أحمر &quot;لالأصباغ Cy5 وضبط الصمام السلطة لكسب فلوريدا uorescencإشارة (ه) من 300 إلى 1000 وحدة مضان في الجهاز MST مع جهاز استشعار قياسية. يستخدم 25٪ من الطاقة الصمام في هذه الدراسة. ملاحظة: ينصح 6000 إلى 18،000 وحدة مضان لMST مع جهاز استشعار عالية الحساسية. </li></ol> 5. شعري المسح الضوئي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء مسح الشعرية للتحقق جوانب نوعية مختلفة من العينة عن طريق اختيار موقف شعري على برنامج &quot;السيطرة&quot; والنقر على &quot;بدء المسح الضوئي كاب&quot; قبل البدء في قياس MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد مسح شعري لمضان تعزيز / تبريد والآثار العالقة (قمم على شكل حرف U أو بالارض) في البرنامج. ملاحظة: مزيد من التفاصيل حول الكشف والتعامل مع مضان والآثار العالقة يمكن العثور عليها في المناقشة. </li></ol> 6. قياس MST ملاحظة: قبل البدء في قياس MST، للتأكد من استبعاد التمسك الآثار، وتعزيز / التبريد الآثار، أوأخطاء pipetting ل، والتأكد من أن مسح شعري يشير إلى أن إشارة فلوريدا uorescence هي SUF فاي cient. لمزيد من التفاصيل، انظر المناقشة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تركيزات يجند من سلسلة تخفيف لموقف الشعرية المعنية في مراقبة البرامج &quot;&quot; النظر في خطوة التخفيف من خلط أبتمر ويجند. (1: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل أعلى تركيز من يجند (5 ملم) لالشعرية # 1، حدد نوع تخفيف الصحيح (هنا، 1: 1)، انقر على التركيز الأقصى، واستخدام وظيفة السحب لتعيين تركيزات المتبقية في الشعيرات الدموية # 2- تلقائيا 16. أقل تركيز هو 152.6 نيوتن متر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل تركيز أبتمر uorescent فلوريدا (هنا، و 100 نيوتن متر) في القسم الخاص بكل من برامج التحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإعدادات الافتراضية، التي كشف عن uorescence فلوريدا لمدة 5 ثانية، تسجيل MST لمدة 30 ثانية، وتسجيل مضان ل 5 ثانية مزيد من بعد تثبيط ر الليزر<html> س مراقبة انتشار الخلفي من الجزيئات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط قوة الليزر إلى 20٪ في قسم منها من برنامج التحكم. ملاحظة: من أجل الحصول على أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولتجنب الآثار غير محددة، فمن المستحسن قوة الليزر من 20-40٪. في حالات معينة، قد تكون هناك حاجة إلى قوة الليزر أعلى للحصول على فصل جيد من الجزيئات غير منضم وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ التجربة بعد اختيار مجلد الوجهة والبدء في قياس MST عن طريق الضغط على زر &#39;&#39; قياس بدء MST &quot;. ملاحظة: سيتم إنشاء الملف .ntp في مجلد الوجهة. باستخدام هذا الإعداد، وقياس واحد يستمر 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء التجريبي على الأقل مرتين لتحديد أكثر دقة للقيمة EC 50. ملاحظة: من أجل اختبار استنساخ التقني، ونفس الشعيرات الدموية يمكن فحصها عدة مرات (تكرار التقنية). </li></ol> 7. تحليل البيانات MST الإقليم الشمالي &quot;&gt; ملاحظة: برامج التحليل يمكن تحليل البيانات على فلوريدا ذ خلال قياس وتحليل البرامج المؤامرات آثار الساعة MST والتغيرات في تطبيع فلوريدا uorescence (F القاعدة) في مقابل تركيز يجند 37. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل برامج التحليل MST (تحليل MO.Affinity) وتحميل الملف .ntp من المجلد الوجهة. حدد &quot;MST&quot; كنوع التحليل في قائمة اختيار البيانات. ملاحظة: في حالة الآثار مضان تعتمد على يجند، مضان الأولي ويمكن اختيار لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة على المدى التقنية والبيولوجية منها (ق) لتحليل جديد عن طريق السحب والإفلات أو عن طريق الضغط على زر &quot;+&quot; أدناه على المدى التجريبية منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر المعلومات الواردة أدناه على المدى التجريبية منها الحصول على معلومات عن خصائص التجربة، آثار MST، مسح شعري، شكل شعري، مضان الأولي، ومعدل التبييض. ملاحظة: هذه البيانات الخام يمكن آللذلك يتعين تفتيشها في خطوات لاحقة من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد البصر آثار MST لتجميع وترسيب الآثار وظاهرة للعيان كما المطبات والمسامير. ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول الكشف والتعامل مع آثار التجميع، قراءة المناقشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد البصر الفحص الشعرية والشعرية شكل غطاء لآثار الامتصاص وظاهرة للعيان كما قمم بالارض أو على شكل حرف U. تفقد البصر الفحص الشعرية ومضان الأولي للآثار مضان. تفقد البصر معدل تبيض ل photobleaching الآثار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع الجرعة والاستجابة وتغيير إعداد تحليل لوضع &quot;الخبير&quot; عن طريق الضغط على زر منها. حدد &quot;تي السريع&quot; كما استراتيجية التقييم MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;هيل&quot; نموذجا للtting منحنى فاي. سيتم تلقائيا تحسب المعلمات ملزم. تطبيع البيانات عن طريق اختيار نوع منها التطبيع في القائمة &quot;مقارنة النتائج&quot;. تصديرالبيانات إما .xls أو قوات الدفاع الشعبي. ملاحظة: يلخص الجدول أدناه الرسم البياني ملزم المعلمات ملزمة حساب. </li></ol>

<ol><li>Linke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microscale+Thermophoresis+Screening+Approach+for+Fragment-Based+Lead+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery.</a> J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScale+Thermophoresis%3A+Interaction+analysis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
<li>Zillner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein%3A+nucleic+acid+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).</li>
<li>Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+for+the+assessment+of+nuclear+protein-binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities.</a> Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat Commun. 1, 100(2010).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59 (3), 301-315 (2013).</li>
<li>Schubert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Df31+protein+and+snoRNAs+maintain+accessible+higher-order+structures+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin.</a> Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).</li>
<li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> J Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).</li>
<li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+Binding+Aptamers%3A+Selection+Strategies%2C+Characterization%2C+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications.</a> Front Chem. 4, 14(2016).</li>
<li>Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+equilibrium+binding+characterization+of+aptamers+to+small+molecules+using+a+label-free%2C+sensitive%2C+and+scalable+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform.</a> Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).</li>
<li>Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+characterization+of+aptamer+kinetic+and+equilibrium+binding+properties+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance.</a> Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li>
<li>Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ligand+binding+to+a+heterogeneous+RNA+population+in+the+malachite+green+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer.</a> Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).</li>
<li>Burnouf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinITC%3A+a+new+method+for+obtaining+joint+thermodynamic+and+kinetic+data+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry.</a> J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).</li>
<li>Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+amino+acids+by+RNA+aptamers%3A+the+evolution+into+an+L-tyrosine+binder+of+a+dopamine-binding+RNA+motif%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif.</a> RNA. 6 (4), 520-527 (2000).</li>
<li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li>
<li>Huizenga, D. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+aptamer+that+binds+adenosine+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A DNA aptamer that binds adenosine and ATP.</a> Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).</li>
<li>Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allosteric+self-splicing+ribozyme+triggered+by+a+bacterial+second+messenger%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger.</a> Science. 329 (5993), 845-848 (2010).</li>
<li>Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+ligand+binding+by+an+adenine-sensing+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch.</a> Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).</li>
<li>Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+heterogeneous+free+state+in+the+formation+of+a+specific+RNA-theophylline+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex.</a> Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).</li>
<li>Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+fluorescence+anisotropy+sensors+for+adenosine+triphosphate+by+comprehensive+screening+tetramethylrhodamine+labeled+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides.</a> Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence+anisotropy+method+for+detection+of+lead+%28II%29+ion+by+a+G-quadruplex-inducible+DNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer.</a> Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+an+in+vitro-evolved+RNA+aptamer+reveals+homogeneous+ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics.</a> J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705(2010).</li>
<li>Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+as+a+sensitive+tool+to+detect+subtle+modifications+in+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins.</a> PLoS One. 7 (2), 31948(2012).</li>
<li>Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+thermophoresis+for+quantifying+the+buffer+dependence+of+aptamer+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).</li>
<li>Entzian, C., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+small+molecule-aptamer+interactions+using+MicroScale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST).</a> Methods. 97, 27-34 (2016).</li>
<li>Valenzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Identification+of+DNA+Aptamers+to+Tyramine+Using+in+Vitro+Selection+and+High-Throughput+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing.</a> ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).</li>
<li>Jauset Rubio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Conglutin+dual+aptamers+binding+distinct+aptatopes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes.</a> Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Binding+Studies+Using+MicroScale+Thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis.</a> Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).</li>
<li>Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Selection+and+Interaction+Studies+of+a+DNA+Aptamer+Targeting+Protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A.</a> PLoS One. 10 (7), 0134403(2015).</li>
<li>Kinghorn, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Affinity+Maturation+by+Resampling+and+Microarray+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection.</a> Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).</li>
<li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).</li>
<li>Braun, D., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+DNA+by+thermophoretic+depletion+and+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection.</a> Phys Rev Lett. 89 (18), 188103(2002).</li>
<li>Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophoresis+of+DNA+determined+by+microfluidic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).</li>
<li>He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylate+Charge+Regulates+Sensor+Kinase+CheS3+To+Control+Cyst+Formation+in+Rhodospirillum+centenum%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum.</a> MBio. 6 (3), 00546(2015).</li>
<li>Brvar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+discovery+of+substituted+4%2C5%27-bithiazoles+as+novel+DNA+gyrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors.</a> J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).</li>
<li>Pogorelcnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4%2C6-Substituted-1%2C3%2C5-triazin-2%281H%29-ones+as+monocyclic+catalytic+inhibitors+of+human+DNA+topoisomerase+IIalpha+targeting+the+ATP+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site.</a> Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).</li>
<li>Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+signaling+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of signaling aptamers.</a> Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).</li>
<li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Ramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cocaine-antibody+interactions+in+buffer+and+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum.</a> PLoS One. 7 (7), 40518(2012).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+and+interaction+mechanisms+study+of+novel+glucopyranoside+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives.</a> Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+recognition+of+the+granuphilin+C2A+domain+with+PI%284%2C5%29P2%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lipids%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2.</a> Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).</li>
<li>Harazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+of+UDP-N-Acetylglucosamine+2-Epimerase%2FN-Acetylmannosamine+Kinase+%28GNE%29+and+Alpha-Actinin+2+Is+Altered+in+GNE+Myopathy+M743T+Mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant.</a> Mol Neurobiol. , (2016).</li>
</ol>

م، وTS هم موظفون من 2bind محدودة، والتي توفر الخدمات التحليلية الفيزيائية الحيوية. يتم دفع رسوم النشر لهذا الفيديو المادة تكفلها 2bind GmbH المزيد.

مراقبة الجودة: غير محددة الشائكة / امتصاص مادة العينة على الأسطح، وكذلك آثار التجميع، يكون لها تأثير كبير على نوعية البيانات تقارب. ومع ذلك، سوى عدد قليل من التقنيات للدولة من بين الفن وتوفر خيارات دقيقة وسريعة لرصد وتجنب هذه الآثار. تقدم MST ضوابط الجودة المتكاملة التي تكشف عن وتساعد على التغلب على هذه القضايا، والسماح لتحسين تدريجي من الإعداد التقني. ويمكن استخراج معلومات مهمة عن الشائكة ومضان الآثار من الفحص الشع...

التفاعل بين الجزيئات هو أساس الطبيعة. ومن هنا، والعلماء في العديد من مجالات البحوث الأساسية والتطبيقية محاولة لفهم المبادئ الأساسية للتفاعلات الجزيئية من أنواع مختلفة. الميكروسكيل Thermophoresis (MST) تمكن العلماء من أداء ودقيقة، وتوصيف سريع، ومراقبة الجودة فعالة من حيث التكلفة من التفاعلات الجزيئية في الحل، مع حرية اختيار المخازن. وهناك بالفعل أكثر من 1000 المنشورات باستخدام MST، اعتبارا من عام 2016 وحده، واصفا أنواع مختلفة من التحليلات، بما في ذلك عروض مكتبة، ملزمة التصديقات الحدث، فحوصات المنافسة، والتجارب مع شركاء ملزم متعددة 1-8. بشكل عام، يسمح MST دراسة المعلمات ملزمة الكلاسيكية، مثل تقارب ملزمة (بعد الظهر لملم)، رياضيات الكيمياء، والديناميكا الحرارية، من أي نوع من التفاعل الجزيئي. وهناك ميزة كبيرة من MST هي القدرة على دراسة الأحداث ملزمة مستقلة عن حجم شركاء التفاعل. حتى شالالتفاعلات lenging بين الأبتامرات الحمض النووي صغيرة (15-30 الإقليم الشمالي) وأهداف مثل الجزيئات الصغيرة، والمخدرات، والمضادات الحيوية، أو الأيض ويمكن قياس. التكنولوجيات الحالية للدولة من بين الفن لتوصيف التفاعلات أبتمر المستهدفة هي إما مختبر مكثفة ومعقدة للغاية أو تفشل في تحديد-أبتمر صغيرة جزيء التفاعلات 9،10. السطح بلازمون الرنين (SPR) المستندة إلى فحوصات 11،12 والنهج المسعرية حقا خالية من التسمية، مثل متساوي الكالوري المعايرة (ITC) 13-15، شطف isocratic 16، التوازن فاي ltration 17،18، في خط التحقيق 19، gel- تحول المقايسات، stopped- آه فلوريدا فلوريدا uorescence الطيفي 20،21، مضان تباين (FA) 22،23، واحد جزيء فلوريدا uorescence التصوير 24،25، والحيوية طبقة التداخل (BLI) 26 هي أيضا إما غير دقيق أو غير متوافق مع جزيء صغير أبتمر التفاعلات. principa الآخرينقضايا لتر من هذه الأساليب هي حساسية منخفضة، وارتفاع استهلاك عينة، الشلل، والقيود النقل الجماعي على الأسطح، و / أو قيود العازلة. فقط عدد قليل من هذه التقنيات توفر ضوابط متكاملة لتجميع وامتصاص الآثار. يمثل MST أداة قوية للعلماء للتغلب على هذا القيد لدراسة التفاعلات بين الأبتامرات والجزيئات الصغيرة 27-29، فضلا عن أهداف أخرى مثل البروتينات 30-33. وتعتمد هذه التقنية على حركة الجزيئات من خلال تدرجات درجة الحرارة. هذه الحركة موجهة، ودعا &quot;thermophoresis،&quot; تعتمد على حجم وتوجيه التهم وقذيفة الماء من جزيء 34،35. الربط ليجند للجزيء ستغير مباشرة واحدة على الأقل من هذه المعايير، مما أدى إلى التنقل thermophoretic تغييرها. بروابط مع أحجام صغيرة قد لا يكون لها تأثير كبير من حيث حجم التغيير من غير منضم إلى دولة منضمة، ولكنها يمكن أن يكون الدكتور<html> آثار amatic على قذيفة الماء و / أو تهمة. التغييرات في حركة thermophoretic من جزيئات بعد التفاعل مع الشريك ملزم تمكن الكمي من المعلمات ملزمة الأساسية 2،7،34،36،37. كما هو مبين في الشكل 1A، ويتكون الجهاز MST ليزر الأشعة تحت الحمراء التي تركز على العينة داخل الشعيرات الدموية الزجاج باستخدام نفس البصريات، وللكشف عن مضان. يمكن رصد حركة thermophoretic من البروتينات عن طريق uorescence فلوريدا لا يتجزأ من tryptophans 6 أو تفاعل شريك 3،8 fluorescently المسمى في حين أن الليزر يؤسس التدرج في درجة الحرارة (ΔT من 2-6 درجة مئوية). الفرق في درجة الحرارة مما أدى إلى الفضاء، ΔT، يؤدي إلى نضوب أو تراكم الجزيئات في مجال درجات الحرارة المرتفعة، والتي يمكن قياسها كميا بواسطة سوريه coef فاي cient (S T): ز &quot;/&gt; ج يمثل الساخنة التركيز في منطقة ساخنة، وج البرد هو تركيز في المنطقة الباردة الأولية. كما هو مبين في الشكل 1B، نموذجية MST نتائج التجربة في ملف تعريف حركة MST (الوقت أثر)، ويتألف من المراحل المختلفة، والتي يمكن أن تكون مفصولة الجداول الزمنية الخاصة بكل منها. يتم قياس مضان الأولي في أول 5 ثوان في غياب التدرج في درجة الحرارة لتحديد مضان بدءا دقيقة وللتحقق ل photobleaching أو photoenhancement. الوثب درجة الحرارة (T-السريع) يمثل المرحلة التي التغييرات مضان قبل حركة thermophoretic. هذا الانخفاض الأولي في مضان يعتمد على التغييرات التي تعتمد على الحرارة من فلوريدا uorophore العائد الكم. يتبع مرحلة thermophoresis، التي ينخفض ​​مضان (أو زيادة) نتيجة لحركة thermophoretic من الجزيئات حتى توزيع ثابتة للدولة يتم التوصل.ويمكن ملاحظة أن TJump العكس ونشر الظهر يصاحب ذلك من الجزيئات uorescent فلوريدا كما هو مبين في الشكل 1B بعد يتم فيها تشغيل الليزر قبالة. من أجل الوصول إلى معايير ملزمة الأساسية، ويتم تحليل نسب المولي مختلفة من شركاء التفاعل ومقارنة. عادة، يتم دراسة 16 نسب مختلفة في تجربة MST واحد، في حين يتم الاحتفاظ جزيء مرئية بصري مستمر ويتم توفيره مع كمية متزايدة من يجند الخالي من الملصقات. التفاعل بين الشركاء ملزم اثنين يؤدي الى تغييرات في thermophoresis، وبالتالي في uorescence فلوريدا تطبيع، F القاعدة، والذي يحسب على النحو التالي: <img alt="معادلة" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F الساخنة والباردة F تمثل متوسط كثافة uorescence فلوريدا في دي فاي نقطة زمنية نيد من آثار MST. الانتماءات الملزمة (ك د أو EC 50 القيم) ويمكن حساب من المنحنياتالبريد المناسب (الشكل 1C). وعموما، MST هو أداة قوية لدراسة التفاعلات الجزيئية من أي نوع. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول لوصف التفاعل تحديا بين ثلاثي صغيرة جزيء الفوسفات (ATP؛ 0.5 كيلو دالتون) و25 الإقليم الشمالي القصير ssDNA أبتمر DH25.42 (7.9 كيلو دالتون). على مدى المخطوطة، يتم تعيين موقع ملزم للأبتمر على جزيء ATP وصولا الى مجموعة الأدينين من لاعبي التنس المحترفين.

<table><tbody><tr><td>أبتامر ملزمة عازلة</td><td></td><td></td><td>20 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.6; 300 مللي كلوريد الصوديوم; 5 مللي مولار MgCl2; 0.01٪ Tween-20</td></tr><tr><td>ATP aptamer IDT</td><td>, Leuven, Belgium</td><td></td><td>التسلسل: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&nbsp;</td><td>A2383</td><td>حلول مخزون 10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich ، ألمانيا &nbsp ؛</td><td>A8626</td><td>حلول مخزون 10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&nbsp;</td><td>C1506</td><td>حلول مخزون 10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&nbsp;</td><td>حلول مخزون G8877</td><td>10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies ، ميونيخ ، ألمانيا</td><td>MO-G008</td> جهاز <td>MST أزرق / أحمر مع كاشف قياسي ، Monolith NT115 pico هو جهاز MST مع كاشف عالي الحساسية</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 الشعيرات الدموية Standard</td><td>NanoTemper Technologies ، ميونيخ ، ألمانيا</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب Eppendorf PCR</td><td>Eppendorf ، ألمانيا</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>برنامج التحكم Monolith. 2.1.33 ، مثبت مسبقا على الجهاز</td><td>تقنيات NanoTemper ، ميونيخ ، ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>تحليل MO.affinity v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies ، ميونيخ ، ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>برنامج</td><td></td><td></td> التآزر</tr></tbody></table>

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على atp عن طريق الميكروسكيل thermophoresis

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

يعد توصيف التفاعلات الجزيئية من حيث معلمات الربط الأساسية مثل تقارب الربط ، وقياس التكافئ ، والديناميكا الحرارية خطوة أساسية في العلوم الأساسية والتطبيقية. الرحلان الحراري MicroScale (MST) هو طريقة فيزيائية حيوية حساسة للحصول على هذه المعلومات المهمة. بالاعتماد على تأثير فيزيائي يسمى الرحلان الحراري ، والذي يصف حركة الجزيئات من خلال تدرجات درجة الحرارة ، تسمح هذه التقنية بالتحديد السريع والدقيق لمعلمات الربط في المحلول وتسمح بالاختيار الحر لظروف المخزن المؤقت (من المخزن المؤقت إلى المحللات / السيلا). يستخدم MST حقيقة أن الجزيء غير المرتبط يعرض حركة حرارية مختلفة عن الجزيء المعقد مع شريك ملزم. تتغير الحركة الحرارية في لحظة التفاعل الجزيئي بسبب التغيرات في الحجم والشحنة وغلاف الترطيب. من خلال مقارنة ملامح الحركة للنسب الجزيئية المختلفة لشريكي الربط ، يمكن تحديد المعلومات الكمية مثل تقارب الربط (pM إلى mM). حتى التفاعلات الصعبة بين الجزيئات ذات الأحجام الصغيرة ، مثل الأبتامير والمركبات الصغيرة ، يمكن دراستها بواسطة MST. باستخدام تفاعل النموذج المدروس جيدا بين DH25.42 DNA aptamer و ATP ، توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لتوصيف تفاعلات aptamer - الجزيئات الصغيرة. توضح هذه الدراسة أن MST حساس للغاية ويسمح برسم خرائط لموقع الارتباط لأبتامر الحمض النووي 7.9 كيلو دالتون إلى الأدينين من ATP.

في هذه الدراسة، تم تطبيق MST لتميز موقع ملزم للأبتمر DH25.42 الحمض النووي 18 على ATP. وعلى النقيض من الدراسات الأخرى التي تميز تفاعل ATP أو ATP-محاكاة جزيئات صغيرة مع البروتينات وصفت بشكل عشوائي مع واحد أو أكثر من fluorophores 38-40، وتشمل هذه الدراسة نسخة المسمى من أبتمر 7.9 كيلو دالتون ssDNA مع واحد جزيء Cy5 في نهاية 5&#39; . المشتقات ATP مختلفة والجزيئات ذات الصلة، وجميع المختلفة من ATP في مناصب مختلفة استخدمت، لرسم خريطة ل...

MicroScale Thermophoresis (MST) هي تقنية حساسة لتوصيف تفاعلات aptamer المستهدفة. تصف هذه المخطوطة بروتوكول MST لتوصيف تفاعلات الجزيئات الصغيرة aptamer.

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف التفاعلات بين جزيئات DNA aptamer والجزيئات الصغيرة، بما في ذلك رسم خرائط موقع الارتباط، باستخدام تقنية القياس الحراري الدقيق (microscale thermophoresis). يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول معايير الارتباط الأساسية للتفاعلات الجزيئية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها لا تعتمد على حجم الشريك المتفاعل، مما يسمح بالحصول على بيانات مراقبة الجودة للتفاعلات الصعبة بين aptamers والجزيئات الصغيرة.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية واضحة حول التفاعلات بين الأبتامرات والجزيئات الصغيرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على تفاعلات جزيئية أخرى مثل تفاعلات الدواء والهدف أو تفاعلات المستضد/الجسم المضاد. لبدء الإجراء، قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 100 micromolar من أبتامر DNA DH25.42 المسمى بـ Cy5 في ماء مقطر. بعد ذلك، قم بتخفيف محلول الأبتامر المخزون إلى 200 nanomolar باستخدام محلول الربط المنظم.قم بتحضين محلول الأبتامر العامل لمدة دقيقتين عند 90 درجة مئوية. برد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة باستخدام الثلج. بعد ذلك، قم بتمييز وتجهيز أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 200 microliter منخفضة الارتباط لإجراء تخفيف تسلسلي من 16 خطوة للرابط المراد اختباره.انقل باستخدام الماصة 20 µL من محلول مخزون للرابط (ligand) بتركيز 10 mM ومحلول ربط منظم (binding buffer) إلى الأنبوب 1. انقل 10 µL من محلول الربط المنظم إلى الأنابيب من 2 إلى 16. ثم انقل 10 µL من المخزون للرابط من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2، وامزجه جيداً باستخدام الماصة.انقل 10 µL من الخليط المخفف إلى الأنبوب 3 وامزجه جيداً. استمر في التخفيف التسلسلي بهذه الطريقة، مع تصحيح تأثيرات تخفيف المنظم إذا لزم الأمر، وتخلص من الـ 10 µL الزائدة من الأنبوب 16 عند الانتهاء. أضف 10 µL من محلول عمل الأبتامر إلى كل تخفيف وامزجه جيداً باستخدام الماصة.قم بتحضين العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اسحب كل خليط إلى أنبوبة شعرية قياسية نظيفة، مع الحرص على لمس طرفي الأنبوبة الشعرية فقط. ضع الأنابيب الشعرية في حامل الصينية بترتيب تنازلي حسب التركيز.قم بتشغيل جهاز MST وافتح برنامج التحكم في الجهاز. قم بتفعيل التحكم اليدوي في درجة الحرارة واضبط درجة حرارة الجهاز على 25 درجة مئوية. وبمجرد وصول الجهاز إلى درجة الحرارة الصحيحة، أدخل صينية الشعيرات الدموية.اضبط قناة الـ LED على اللون الأحمر لـ aptamer المسمى بـ Cy5. اضبط قدرة الـ LED للوصول إلى إشارة فلورية تبلغ 500 وحدة. ثم قم بإجراء مسح شعيري لتحديد مواضع الشعيرات والتحقق من جودة العينة.إذا كانت القمم الناتجة على شكل حرف U أو مسطحة، فقم بتحضير عينات جديدة في شعيرات مطلية لتقليل تأثيرات الالتصاق. في برنامج جهاز MST، أدخل تركيز الربيطة ونوع التخفيف للشعيرة الأولى. انقر واسحب لملء التركيزات والتخفيفات للشعيرات المتبقية.أدخل تركيز الأبتامر في المزيج النهائي. تأكد من ضبط طريقة التجربة للكشف عن الفلورية لمدة خمس ثوانٍ، وتسجيل MST لمدة 30 ثانية، ثم تسجيل الفلورية لمدة خمس ثوانٍ بعد إيقاف تشغيل الليزر. اضبط قدرة الليزر على 20% وحدد مسار الملف واحفظ ملف التجربة.ابدأ بعد ذلك قياس MST. احصل على ثلاثة قياسات على الأقل بهذه الطريقة. لبدء تحليل البيانات، افتح برنامج تحليل MST وقم بتحميل ملف التجربة.اختر MST لنوع التحليل. يتيح برنامج التحليل مقارنة التكرارات التقنية حيث كانت جميع القياسات لمجموعة واحدة من الشعيرات. كما يمكن إضافة التكرارات البيولوجية من مجموعة مختلفة من الشعيرات إلى التحليل أيضاً.انقر فوق زر المعلومات الموجود أسفل القياس الأول. افحص آثار MST بحثاً عن أي نتوءات أو ارتفاعات حادة تشير إلى تأثيرات التجميع أو الترسيب. ثم افحص مسح الشعيرة وتراكب شكل الشعيرة بحثاً عن قمم مسطحة أو على شكل حرف U تشير إلى تأثيرات الالتصاق أو الامتصاص.بما أن التجمعات وتأثيرات الامتصاص يمكن اكتشافها بسرعة في تقنية MST، فإن هذه الطريقة تتيح تحسيناً سريعاً للإعدادات التقنية لضمان الجودة المثلى للبيانات. تحقق من وجود تأثيرات إخماد أو تعزيز الفلورة المعتمدة على الربيطة في المسح الشعري والفلورة الأولية. افحص تغير الفلورة بمرور الوقت للبحث عن علامات التبييض الضوئي أو التعزيز الضوئي.بمجرد التحقق من جودة البيانات، انتقل إلى وضع الاستجابة للجرعة. اختر إعداد التحليل الخبير في استراتيجية تقييم T Jump MST. ثم اختر نموذج هيل (hill model) لملاءمة المنحنى لحساب معاملات الارتباط تلقائياً.في قائمة مقارنة النتائج، اختر نوع التسوية. قم بتصدير البيانات المسواة كملف جدول بيانات أو ملف PDF. في هذا الإجراء، استُخدمت تقنية MST لدراسة تفاعلات الارتباط لأبتامر DNA أحادي السلسلة مع مجموعة مختارة من ربيطات الجزيئات الصغيرة.تمت مطابقة منحنيات MST باستخدام معادلة هيل وتحديد قيم التركيز الفعال النصفي الأقصى. وفي خمس قياسات بيولوجية مكررة ومستقلة للأبتمر مع ATP، أظهر تفاعل الأبتمر مع ATP سعة ارتباط سلبية تتراوح بين 6 إلى 13 وحدة، وقيمة EC50 متوسطة تبلغ حوالي 52.3 micromolar. وتم تطبيع بيانات كل ربيطة وفقاً لكسر الجزيئات المرتبطة ثم مقارنتها.تشير قيم EC50 لكل من ADP وAMP وSAM مقارنة بـ ATP إلى أن عدد مجموعات الفوسفات له تأثير طفيف على الأكثر في سلوك ارتباط الأبتامر. كما أظهرت إزالة مجموعة الهيدروكسيل من الريبوز في الموضع C2 تأثيراً طفيفاً فقط على ألفة ارتباط الأبتامر. ولم يرتبط الأبتامر في غياب مجموعة الاقتران أو في حال تغيير مجموعة الاقتران إلى جوانين.ارتبط الأبتامر بالأدنينين وحده، مما يشير بشكل أكبر إلى أن مجموعة الأدنينين هي موقع الارتباط الرئيسي للأبتامر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكنها توفير معلومات أساسية حول معايير الارتباط الأساسية في غضون دقائق إلى ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

سيليكس بروتوكولات تشمل جولات متعددة من الاختيار ، كل منها تتطلب تجديد يغاندس ملزمة ، وهذا بدوره يتطلب تسلسل التمهيدي ثابتة في المناطق المحيطة مكتبة عشوائي. يمكن لهذه التسلسلات التمهيدي الثابتة تتداخل مع عملية التحديد (كاذبة ايجابيات وسلبيات). هنا نقدم التمهيدي خالية من البروتوكول.

خالية من التحديد التمهيدي Aptamer باستخدام مكتبة DNA عشوائية

يوضح هذا الفيديو الرحلان الحراري المجهري لدراسة التفاعل بين البروتين والدهون. يكتشف الاختبار التفاعل بين الجزيئات عن طريق تحديد الحركة الحرارية للبروتينات المسماة بالفلورسنت استجابة لتدرج درجة الحرارة. يتم خلط جزيء الفلورسنت بتركيزات مختلفة من جزيئات الدهون غير الفلورية ، ويتم تحميل خليط الجزيئات في المحلول في الشعيرات الدموية. يتم تطبيق تدرج درجة الحرارة على العينات الموجودة في الشعيرات الدموية ، ويتم الكشف عن حركة جزيء الفلورسنت في تدرج درجة الحرارة وتسجيله.

الرحلان الحراري المجهري لدراسة تفاعلات البروتين والدهون في المحلول

thermophoresis الميكروسكيل (MST) يمكن استخدامها على نطاق واسع لتحديد تقارب ملزمة دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. البروتوكول ينطوي overexpression من البروتين GFP تنصهر، تحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف، والكشف عن إشارة MST في وجود تركيزات من يجند متفاوتة.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

يتم توفير بروتوكول لتحديد أجهزة تبديل الهيكل لأهداف الجزيئات الصغيرة بناء على طريقة اختيار حبة مغناطيسية صارمة قابلة للضبط. تعتبر Aptamers المختارة بخصائص تبديل الهيكل مفيدة للمقايسات التي تتطلب تغييرا توافقيا للإشارة إلى وجود هدف ، مثل مقايسة الجسيمات النانوية الذهبية الموصوفة.

منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص

ويرد وضع بروتوكول للتحديد في المختبر وتوصيف الابتامرات الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك الخاصة بالمجموعة. ويرد أيضا تطبيق ابتمر المحدد في أبتاسينسور الكهروكيميائية.

اختيار ابتمر الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك وتوصيف وتطبيق أبتاسينسور الكهروكيميائية

يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين بالمستقبلات في الوقت الفعلي في بيئة خلوية. يتم قياس الارتباط على أنه نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين مشتقات نيوكليوتيدات ثلاثي نيتروفينيل والبروتين المسمى بحمض أميني فلوري غير قانوني.

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

يصف هذا البروتوكول استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) لتحليل حركية الارتباط والتفكك للربط بين أبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين، بما في ذلك إعداد العينات، وتشغيل المعايير والعينات، وتفسير البيانات الناتجة.

تحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين باستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة

الخطوة الضرورية في تطوير أبتامير مضاد للسرطان هي اختبار ارتباطه بالهدف. نعرض مقايسة قائمة على التدفق الخلوي لدراسة هذا الارتباط ، مع التأكيد على أهمية تضمين أبتامير التحكم السلبي والخلايا السرطانية الإيجابية أو السلبية لهذا البروتين المعين.

مقايسة ربط بروتين سطح الخلية القائمة على قياس التدفق الخلوي لتقييم انتقائية وخصوصية أبتامير مضاد للسرطان

يوضح البروتوكول الحالي استخدام مقايسة تضخيم أسي سريعة من 3 مراحل قائمة على aptamer للكشف عن الأهداف. يتم تغطية تحضير العينة وتضخيم الإشارة وتطوير اللون لتنفيذ هذا النظام للتعرف على وجود الثيوفيلين على الكافيين.

يتم تسهيل الكشف عن الهدف القائم على Aptamer بواسطة تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة G-quadruplex من 3 مراحل

يحدد هذا البروتوكول تصميم مجسات التهجين المنقسمة باستخدام أبتامر الإضاءة الفلورية DAP-10-42 كمراسل إشارة وتطبيقها للكشف عن الحمض النووي والتمايز بين الأهداف ذات بدائل أحادية النيوكليوتيدات.

مسبار التهجين المنفصل باستخدام أبتامر إضاءة فلورسنت للحمض النووي كمراسل إشارة لتحليل الحمض النووي الخاص بالتسلسل

استكشف تقنية الميكروسكيل ثيرموفوريسيس لتوصيف تفاعلات الأبتامرات مع الجزيئات الصغيرة ورسم مواقع الارتباط. تتيح هذه الطريقة تحديد معاملات الارتباط بدقة عالية في محلول.

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

استكشف المزيد من الفيديوهات