الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد

تُعد تقنية الفصل الكهربائي الشعيري للخلايا في الوقت الحاضر واحدة من أكثر الوسائل دقة وحساسية لتحليل الجزيئات الحيوية مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة. ومع ذلك، فإن التنفيذ الناجح لهذه التقنية يعتمد على معرفة ومهارات المحلل في الخطوات الحرجة أثناء تحضير العينات والنظام. يهدف هذا البرنامج التعليمي إلى توضيح كيفية إجراء تحليل ناجح، مع تقديم شرح تفصيلي دقيق لتحضير المحاليل والعينات، وتجهيز نظام الفصل الكهربائي الشعيري، وإعداد طريقة تشغيل الأجهزة، واتخاذ القرارات بشأن البيانات ومعالجتها.

بشكل عام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتطوير وتحسين مهارات الموظفين المشاركين في تجهيز مختبرات الكيمياء التحليلية. قم بوزن كمية من HPMC للحصول على تركيز نهائي قدره 0.05% في 100 millileters. وبما أن HPMC هو بوليمر مرن أساسي، فكخطوة أولى، اسكب المسحوق في دورق زجاجي، وأضف 80 milliliters من الماء ببطء لتفكيك المسحوق.

بعد ذلك، اشطف صينية الترطيب بالماء لإزالة آثار المسحوق. أضف الكواشف المتبقية كالمعتاد وحرك المحلول. اضبط قيمة pH إلى 4.8 باستخدام حمض الأسيتيك بتركيز 50%.

واترك المحلول ليستقر لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اضبط الـ pH حسب الضرورة. أضف الماء لاستكمال الحجم النهائي إلى 100 milliliters.

قم بترشيح محلول BG المُحضّر عبر غشاء متعادل، ثم صبّه في زجاجة. وأخيراً، ضع ملصقاً مناسباً على الزجاجة، واحفظها مبردة. ومن أجل تحضير العينة، أضف في الخطوة الأولى 162 µL من محلول buffer العناصر الزهيدة إلى أنبوب سعة 1.5 mL.

ثم أضف 18 µL من عينة خريطة تم تحضيرها مسبقاً بتركيز 10 mg/mL. وفي الخطوة الثالثة، أضف 20 µL من محلول هيستامين بتركيز 1% تم تحضيره مسبقاً للحصول على حجم عينة نهائي قدره 200 µL. في الخطوة التالية، قم بتحضير العينة لمدة خمس ثوانٍ.

ثم يتم إجراء الطرد المركزي لمدة خمس ثوانٍ. اسحب الحجم الكلي للعينة. ثم قم بتفريغها إلى الأعلى في أنبوب دقيق (micro-vial) لتجنب إدخال أي فقاعات.

أخيرًا، قم بتغطية القارورة واحتفظ بها مبردة. أوقف تشغيل جهاز CE بالضغط على مفتاح الطاقة، ثم افتح الباب الأمامي.

ضع مسحة تنظيف جديدة تحت كتلة الواجهة. اشطف الأقطاب الكهربائية عبر كتلة الواجهة بالماء باستخدام زجاجة غسيل. اترك الماء يقطر عبر الثقوب ثم جفف كتلة الواجهة جيداً.

قم بإزالة الماء الزائد من الأقطاب الكهربائية بعناية باستخدام الممسحة. احذر من لمس الأقطاب الكهربائية أثناء هذه العملية. قم بإزالة الممسحة من نظام تثبيت العينة.

نظف سطح صواني العينات باستخدام مسحة جديدة مبللة بالماء. ونظف أيضاً سطح صواني المحلول المنظم. اسحب صواني المحلول المنظم للأعلى، وارفع نظام تثبيت العينات، ثم نظف أسطحها باستخدام المسحة.

أعد صواني المحلول المنظم إلى موضعها. بعد ذلك، نظف كتلة الواجهة جيداً. نظف قضيب التثبيت ومبيت مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

في النهاية، تأكد من تجربة النظام قبل الاستخدام. اشطف روافع الفتح بالماء باستخدام زجاجة غسيل. نظف سطحها جيداً باستخدام مسحة جديدة غير متناثرة لإزالة الغبار والأملاح المتراكمة.

أخيرًا، تأكد من تجربتهم قبل التركيب. نظف الطرفين النهائيين لكابل الألياف الضوئية بقطعة قماش من الألياف الدقيقة مبللة بالماء، وتحقق من وجود وحدة الإضاءة بين الطرفين. أخرج شعيرة محايدة جديدة من عبوتها.

خذ الآن أحد طرفي الأنبوب الواقي للشعيرة إلى طاولة العمل. قم بفك وتسوية الأنبوب البلاستيكي، ثم اسحب الشعيرة من الأنبوب بعناية. ثبت قطعة من الورق على طاولة العمل مع وضع علامات القياس التالية.

قم بمحاذاة نافذة الشعيرية مع نقطة الصفر لعلامات القياس بالسنتيمتر على النحو التالي: بعد ذلك، قم بتثبيت طرفي الشعيرية على طاولة العمل باستخدام شريط لاصق. ضع علامة على طرفي الشعيرية على بُعد 2 mm خارج علامات القياس. ثم اقطع الغطاء الواقي عند طرف الشعيرية الأبعد عن النافذة.

اغمر طرف الشعيرة في قارورة CE مملوءة بالماء لتجنب حدوث تلف دائم في الطلاء الداخلي للشعيرة. أخرج الشعيرة من القارورة وأدخل هذا الطرف بعناية في جانب المخرج من الخرطوشة. بمجرد ظهور الشعيرة من الجانب الآخر، اسحب القدر اللازم حتى تصبح نافذة الشعيرة ممركزة مع نافذة الخرطوشة كما يلي.

بعد ذلك، قم بتدوير الخرطوشة وأدخل سدادة الفتحة في نافذة الخرطوشة، مع الضغط حتى تستقر في مكانها. احذر من كسر نافذة الشعيرة أثناء هذا الإجراء. تأكد من مرور الضوء عبر النافذة عند تعريضها لمصدر ضوئي واسع.

أدخل الشعيرة في أنبوب التبريد المُعد مسبقاً مع تركيب صواميل الأنابيب والحلقة المانعة للتسرب (o-ring) مسبقاً. ادفع الشعيرة عبر الأنبوب حتى تظهر الشعيرة من الجانب الآخر. بعد ذلك، أدخل طرف الأنبوب في جانب المخرج من الخرطوشة، وأحكم ربط صواميل الأنابيب.

أدخل طرف مدخل الشعيرة في جانب المدخل من الخرطوشة. وبمجرد ظهور الشعيرة في الجانب الآخر، اسحبها حسب الضرورة. بعد ذلك، أدخل طرف الأنبوب في جانب المدخل من الخرطوشة وأحكم ربط صواميل الأنبوب.

اقطع الغطاء الواقي عند طرف الشعيرة الأقرب من النافذة. ثم قم بتركيب مشابك تثبيت الخلية فوق أطراف الشعيرات، مع الضغط لتثبيتها في موضعها كما يلي. اقطع أطراف الشعيرات أسفل خطوط المرجع الموجودة على ألواح إطالة الشعيرات.

تأكد من فحص نهايات الشعيرات باستخدام عدسة مكبرة. إذا لم تكن نهايات الشعيرات ملساء، قم بصقلها باستخدام حجر Cleven. ضع الحلقة الدائرية (o-ring) الخاصة بالفتحة في الثقب الأزرق للفتحة.

ثم أدخله بعناية باستخدام أداة إدخال الحلقة الدائرية (o-ring). وأخيراً، قم بتركيب قوارير CE المملوءة بالماء في غطاء الخرطوشة، وضع الخرطوشة في الغطاء فوراً مع إدخال النهايات الشعيرية في القوارير واحفظها تحت التبريد. اضبط حجم الماصة.

أضف الحجم الصحيح من الماء إلى مدخل المنظم في إحداثيات الصينية A1 وB1 وF6، وإلى مخرج المنظم في إحداثيات الصينية A1 وB1 وC1 وE6 وF6. أضف HCl 0.1 normal إلى مدخل المنظم في إحداثيات الصينية C1 وE6. وأضف BGE إلى مدخل المنظم في إحداثيات الصينية D1 وE6، وإلى مخرج المنظم في الإحداثية D1. وأخيراً، أغلق جميع قوارير الـ CE في صواني مدخل ومخرج المنظم. أثناء الإجراء، تجنب ترطيب أغطية القوارير لمنع تسرب الكربون. افتح الباب الأمامي لجهاز الـ CE.

أولاً، قم بتركيب كاشف الأشعة فوق البنفسجية (UV detector) وثبته عن طريق تدوير المسمار في اتجاه عقارب الساعة. ارفع الباب الداخلي، وقم بتركيب روافع الفتح عن طريق ضغطها للأعلى في كتلة الواجهة. أدخل كابل الألياف الضوئية في المشبك وأدره في اتجاه عقارب الساعة.

وقم بتوصيل الطرف الآخر بالكاشف. تعامل مع كابل الألياف الضوئية بعناية، لأن الثني قد يؤدي إلى كسره. ضع صينية العينة في نظام تثبيت العينة وثبتها في موضعها.

باتباع الإجراء نفسه، ضع صواني المحلول المنظم في نظام تثبيت العينات. ارفع قضيب التثبيت وضع خرطوشة الشعيرية في كتلة الواجهة. اضغط على قضيب التثبيت من كلا الطرفين وأحكم ربط المقابض عن طريق تدويرها في اتجاه عقارب الساعة.

أغلق الباب الداخلي، ثم أغلق الباب الأمامي. وأخيرًا، قم بتشغيل جهاز CE بالضغط على مفتاح الطاقة. أنشئ طريقة تهيئة الجهاز.

قم بتكوين المعاملات في قسم الظروف الأولية، بما في ذلك الجهد الكهربائي، والخرطوشة، ودرجة حرارة تخزين العينة، وإعدادات التشغيل. اختر 2014 كطول موجي للاكتساب. حدد الإجراءات التي سيقوم الجهاز بتنفيذها من خلال تكوين المعاملات في خلايا البرمجة الزمنية.

بما في ذلك الإعدادات المحددة لكل من خطوات الشطف، والحقن، والفصل. قم بتنفيذ هذا الإجراء لإنشاء طرق تهيئة التشغيل وإيقاف تشغيل الجهاز. الخطوة التالية هي إنشاء تسلسل جديد.

قم ببرمجة الشعيرة للتكييف باستخدام طريقة التكييف. إذا كانت الشعيرة تُستخدم للمرة الأولى، فقم ببرمجة أربع تكرارات. وخلاف ذلك، قم ببرمجة تكرارين.

بعد ذلك، قم ببرمجة العينات المراد تحليلها باستخدام طريقة التشغيل (running method). وأخيراً، قم ببرمجة الشعيرة الكهربائية للتخزين باستخدام طريقة الإيقاف (shut down method). يكتمل تحليل الفصل الكهربائي الشعيري للخلايا في غضون 30 دقيقة.

تتوافق النتيجة الأولى مع المعيار الداخلي للهستامين كمقياس لأداء النظام المناسب. ويلي ذلك أشكال جليدية قاعدية، ورئيسية، وحامضية مميزة للأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تم تقييمها. وتتم عمليات الفصل بأكملها تحت تيار ثابت يبلغ حوالي 30 ميكروأمبير.

بعد تشغيل التجربة، قم بتصدير البيانات الخام من برنامج grab واستيرادها عبر برنامج empower لمعالجتها. يتم الحصول على النسبة المئوية لكل شكل من أشكال البروتين السكري بعد إجراء تكامل خطي رأسي لملف الكروماتوجرام الكهربائي. نوفر هنا دليلاً مفصلاً خطوة بخطوة لإجراء تحليل للأنشطة أحادية النسيلة التي تم إنتاجها بواسطة الفصل الكهربائي الشعري للخلايا.

إلى جانب العديد من التوصيات للتخفيف من المشكلات المحتملة، يوفر البروتوكول الحالي ميزة إمكانية تخصيصه بسهولة لتحليل بروتينات أخرى من خلال إجراء تعديلات طفيفة في معاملات الموصلية والـ pH.