تحليل مفيد آثار المكملات الغذائية على وظائف الأمعاء طلائي الحاجز أثناء التجريبية التهاب القولون

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقييم آثار العناصر الغذائية التكميلية في نموذج الفئران لالتهاب القولون الناجم عن كبريتات ديكستران الصوديوم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة المعوية حول تطور العلوم السريرية في جميع أنحاء اتجاه تجربة نموذج التهاب القولون. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها منخفضة التكلفة ، ولا تتطلب معدات متطورة ، وتوفر تحليلا واضحا لتشكل القولون بأكمله.

يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الإجهاد التأكسدي في القولون نتيجة للتجنيد المفرط للعدلات. لإدارة المكملات الغذائية عن طريق التزقيم ، قم أولا بتقييد الفأر يدويا بواسطة القفص ، ووضع الذيل بين الإصبع الثالث وقاعدة الإبهام. بعد ذلك ، أمسك الماوس في وضع رأسي ، أدخل إبرة التزقيم في الجانب الأيسر من فم واتبع بعناية سقف الفم لتحديد موقع المريء.

إذا لم تتم مواجهة أي مقاومة ، فقم بدفع الإبرة نحو المعدة. قم بتوصيل الحجم الكامل للمكملات ببطء ، متبوعا بإزالة المحقنة بعناية وقياس وزن جسم. قم بتعيين درجة من صفر إلى أربعة وفقا لنسبة فقدان الوزن ، ثم اجمع عينة براز جديدة واستخدم أدوات التطبيق المتوفرة لتطبيق مسحة رقيقة من العينة على شريحة من مجموعة اختبار الدم الخفي في البراز guaiac.

أغلق الغطاء الموجود في مقدمة المجموعة وافتح النافذة الخلفية لتطبيق قطرتين من حل المطور على الجزء الخلفي من موقع العينة. اقرأ النتائج بعد 30 ثانية ، وقم بتعيين درجة من صفر إلى أربعة اعتمادا على قوة الإشارة. ثم لاحظ عينة براز جديدة ثانية لتقييم تناسق البراز ، وتعيين درجة من صفر إلى أربعة حسب الاقتضاء.

لتحديد نفاذية الظهارة المعوية في الجسم الحي ، ضع مخدرا في وضع ضعيف وقم بعمل شق خط الوسط لكشف الأمعاء. حدد موقع الأعور وقم بعمل شق صغير في الجزء القريب من صعود القولون. ثم أدخل إبرة تغذية قياس 22 وقم بتأمين الإبرة برباط خيط حريري مشترك.

اغسل بعناية كمية وفيرة من PBS من خلال الإبرة لشطف كل البراز من القولون ، متبوعا بتركيب محلول إيفانز الأزرق حتى تصل الصبغة إلى فتحة الشرج. بعد 15 دقيقة ، اغسل الأنبوب بحجم زائد من PBS حتى يصبح الغسيل حول الشرج واضحا. ثم استئصال القولون وشطف الأنسجة بمزيد من PBS ، متبوعا بمليلتر واحد من ستة ملليمولار N-acetylcysteine للتخلص من أي صبغة تلتصق بمخاط القولون.

الآن قم بقص القولون طوليا واشطف الأنسجة مرة أخرى باستخدام PBS و N-acetylcysteine ، ثم سجل وزن وطول القولون وضع الأنسجة في ملليلترين من N و N-dimethylformamide في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف لاستخراج الصبغة المتبقية ، وقياس تركيزات الصبغة طيفية ضوئية عند 610 نانومتر في صباح اليوم التالي. بعد سبعة أيام من كبريتات ديكستران الصوديوم ، أو التهاب القولون الناجم عن DSS ، قم بتشريح القولون بالكامل وتسجيل طوله. بالنسبة لللفائف السويسرية ، افتح القولون طوليا ، وقم بإزالة أي مادة برازية بعناية ، واستخدم عصا خشبية رفيعة مستديرة أو ملقطا رفيعة الرؤوس لدحرجة الأنسجة بحيث يكون الغشاء المخاطي متجها للداخل.

ثم ضع الأنسجة بعناية داخل شريط تضمين ، متبوعا بالتثبيت بخمسة ملليلتر من 10٪ فورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة. من الأهمية بمكان لف القولون بإحكام دون طي لتجنب المشاكل أثناء تقطيع الأنسجة ، مما قد يؤدي إلى تلف الأنسجة السريرية والتفسير الخاطئ على أنه تلف مرتبط بالتهاب القولون. بعد 48 ساعة ، اغسل العينة بماء الصنبور لمدة 18 ساعة ، متبوعا بالجفاف بسلسلة الإيثانول.

بعد آخر غمر مطلق للإيثانول ، عالج الأنسجة بأربع حضانات لمدة ساعة واحدة في الزيلين. بعد غمر الزيلين الأخير ، ضع العينة في 50 مل من البارافين السائل لمدة 17 ساعة وثلاث ساعات حضانة. في نهاية الحضانة التي استمرت ثلاث ساعات ، اغمر العينة في قالب بلاستيكي مربع سعة 22 ملم مكعب في ثمانية إلى 10 ملليلتر من البارافين السائل الطازج لمدة 24 ساعة.

عندما يتجمد البارافين ، استخدم ميكروتوم للحصول على أقسام أنسجة بسمك خمسة ميكرون ، ثم اغمر المقاطع العرضية لفترة وجيزة في حمام مائي سعة لتر واحد يحتوي على 0.3٪ جيلاتين وقم بتركيب العينات على الفور على شرائح زجاجية معالجة بالبولي ليسين لتلوين H & E. لتحليل الإجهاد التأكسدي ، قم أولا بإنشاء حاجز حول الأنسجة باستخدام قلم كاره للماء. بعد ذلك ، قم باحتضان ثمانية مقاطع عرضية بالتبريد للأنسجة في خمسة ميكرومولار DHE مذابة في الماء لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.

يتبع الحضانة ثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة في PBS مع تحريك لطيف في درجة حرارة الغرفة. جفف العينات بالهواء وأضف قطرة من وسط التركيب لحماية التألق. ثم لاحظ مضان الإيثيديوم المؤكسد على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر بتكبير 40x.

يؤدي علاج DSS إلى زيادة مستمرة في مؤشر نشاط المرض كما هو متوقع ، حيث يصل إلى أقصى درجة في اليوم السابع بعد التحريض. تؤخر مكملات النظام الغذائي المضادة للالتهابات ظهور التهاب القولون في وقت مبكر ، في حين أن التأثيرات الوقائية تكون هامشية فقط في نقاط زمنية لاحقة. قد يمنع التدخل الغذائي أيضا الزيادات التي يسببها DSS في نفاذية الظهارة المعوية ، وكذلك تقصير طول القولون.

يكشف تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين لأنسجة القولون البعيدة المضمنة في البارافين أن عينات التحكم تظهر مورفولوجيا طبيعية ، في حين أن المعالجة ب DSS تظهر العلامات النموذجية لالتهاب القولون. وتجدر الإشارة إلى أن العلاج الموازي مع مكملات النظام الغذائي يخفف بوضوح من التغيرات المورفولوجية الناجمة عن التهاب القولون مع مورفولوجيا عامة مماثلة لتلك الخاصة بالمجموعة الضابطة. يشير تلطيخ التألق المناعي لأنسجة القولون البعيدة أيضا إلى أن جزيئات الوصلة غير اللاصقة الضيقة يتم استيعابها أثناء التهاب القولون الناجم عن DSS وأن التوطين المشترك لهذه البروتينات يفقد جزئيا عند ملامسات الخلايا الظهارية للسرداب.

الأهم من ذلك ، يتم تقليل هذا الاستيعاب عندما تتلقى الفئران المعالجة ب DSS مكمل غذائي مضاد للالتهابات ومضاد للأكسدة. علاوة على ذلك ، يتم مواجهة تجنيد العدلات القوي في القولون استجابة لالتهاب القولون الناجم عن DSS عن طريق مكملات النظام الغذائي ، مما يؤدي إلى التحسين المتزامن للإجهاد التأكسدي الناجم عن العدلات وانخفاض طفيف في إنتاج السيتوكين الالتهابي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياسات غرفة النزف لتحليل المقاومة الكهربائية للحاجز الظهاري في القولون.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث التهاب القولون واستكشاف الآلية الجزيئية للتسبب في التهاب القولون التقرحي في نموذج فأر قابل للتكرار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل تطور التهاب القولون والآثار المفيدة للمكملات الغذائية على وظائف الحاجز الظهاري المعوي. لا تنس أن العمل مع الحية يتطلب الالتزام بالمعايير الأخلاقية العالية لتجنب المعاناة غير الضرورية.