تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران

تفعيل الالتهام الذاتي هو مفيد في الوقاية من عدد من الأمراض. واحدة من الطرق الفسيولوجية للحث على الالتهام الذاتي في الجسم الحي هو ممارسة الرياضة البدنية. نحن هنا تظهر كيفية تفعيل الالتهام الذاتي عن طريق التمارين الرياضية وقياس مستويات الالتهام الذاتي في الفئران.

الهدف العام من هذه التجربة هو تنشيط الالتهام الذاتي فسيولوجيا في الفئران عن طريق الجري القسري أو الطوعي ، ثم قياس مستويات الالتهام الذاتي في أنسجة معينة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الالتهام الذاتي ، على وجه الخصوص ، كيف يساهم الالتهام الذاتي والعمل في الآثار المفيدة بوساطة التمارين الهوائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التمارين البدنية هي تأثير هوائي سريع بين الالتهام الذاتي في الجسم الحي باستخدام الفئران.

في هذه التجربة ، ابدأ بستة فئران سوداء C57 من ثمانية إلى اثني عشر أسبوعا ، مع إيواء جين متحول للكشف عن الالتهام الذاتي الناجم عن التمرين في الجسم الحي ، والمعروف باسم GFP-LC3. للحصول على تفاصيل حول استخدام أجهزة المشي للفئران ، راجع منشور JoVE التالي. اضبط الحافز الكهربائي لجهاز المشي على كثافة منخفضة.

في أول جلستين ، تأقلم الفئران مع جهاز المشي المفتوح بمقدار عشر درجات. في اليوم الأول ، قم بتمرين الفئران لمدة خمس دقائق مع تشغيل جهاز المشي بسرعة ثمانية أمتار في الدقيقة. في اليوم الثاني ، قم بتشغيل الفئران لمدة عشر دقائق ، في البداية بمعدل ثمانية أمتار في الدقيقة ، وبعد خمس دقائق ، قم بتكثيف السرعة إلى عشرة أمتار في الدقيقة.

في اليوم الثالث ، قم بتشغيل الفئران لمدة 90 دقيقة كاملة. ابدأ جهاز المشي بسرعة عشرة أمتار في الدقيقة وشجع الفئران على الجري باستخدام دفعات لطيفة لتجنب صدمات القدم المتكررة. من الأهمية بمكان مراقبة الفئران والتلاعب بها حتى لا تتلقى الكثير من الصدمات الكهربائية خلال الجري لمدة 90 دقيقة.

طوال الجري ، استخدم أصابعك لتشجيع الفئران على البقاء على جهاز المشي. بعد 40 دقيقة ، 6زيادة السرعة بمقدار متر واحد في الدقيقة. بعد 50 دقيقة ، قم بزيادة السرعة بمقدار متر واحد في الدقيقة مرة أخرى.

بعد 60 دقيقة ، قم بزيادة السرعة بمقدار متر آخر في الدقيقة. بعد 70 دقيقة ، ابدأ في زيادة السرعة كل خمس دقائق بحيث تكون الدقائق الخمس الأخيرة من الجري لمدة 90 دقيقة 17 مترا في الدقيقة. بعد نهاية التجربة ، قم على الفور بالقتل الرحيم للفئران لجمع الأنسجة إذا رغبت في ذلك.

في هذا الاختبار ، قم بإسكان الفئران بشكل فردي. استخدم نفس السلالة كما هو موضح سابقا. قم بإعداد عجلة تشغيل ماوس بقطر 11.4 سم مع عداد مسافات الدراجة المرفق.

يجب أن يبلغ قياس كل دوران 358 ملم من السفر. حرك الماوس إلى القفص الذي يحتوي على العجلة واترك الماوس يستخدمه بحرية لمدة أسبوعين. كل 24 ساعة ، سجل المسافة التي يقطعها الماوس من عداد المسافات.

بعد أسبوعين ، حصاد الأنسجة لتحليلها حسب الحاجة. لقياس التدفق الذاتي ، عالج الفئران بمثبط الالتهام الذاتي ، الكلوروكين ، لمدة ثلاثة أيام. قم بإذابة الكلوروكين في PBS بمعدل خمسة ملليغرام لكل مليلتر وحقنه في الفئران داخل الصفاق بجرعة 50 ميكروغرام لكل جرام.

أعط الفئران حقنة واحدة يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية وحصاد الأنسجة بعد ثلاث ساعات من الحقن الأخير. بالنسبة للفئران التي تمارس جهاز المشي ، ابدأ الجري لمدة 90 دقيقة بعد 90 دقيقة من الحقن في اليوم الثالث حتى ينتهي الجري بعد ثلاث ساعات من الحقن. ثم قتل الفئران وحصاد أنسجتها على الفور.

استعد لإغزارة في غضون 90 دقيقة من التمرين عن طريق تحضير المثبت. قم بتحميل حقنة سعة 30 ملليلتر مع 15 إلى 20 مل من أربعة بالمائة من بارافورمالدهيد الطازج وقم بتوصيل المحقنة بإبرة قسطرة قياس 20. قم بتوصيل مضخة الحقنة المحملة واضبطها على 90 مل في الساعة من التدفق المستمر.

مع وجود على سطح عمل نظيف ، في وضع ضعيف ، افتح التجويف الصدري من خلال الحجاب الحاجز لكشف القلب. الآن ، أدخل إبرة القسطرة في البطين الأيمن. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير في الكبد لتصريف الدم وبدء المضخة.

حقن المثبت حتى تصبح الرئة والكبد شاحبة تماما. عادة ، يكفي 15 مل من المثبت. بعد الوفرة ، قم بإزالة الإبرة وجمع الأنسجة ذات الأهمية.

لجمع العضلات الهيكلية ، قم بتشريح العضلات الجانبية. اسحب جلد الساق لفترة وجيزة للخلف لكشف العضلات وتوطين عضلات الفخذ الفخذية. بعد ذلك ، قم بتشريح العضلات الوحشية الواسعة ، وهي العضلة الخارجية المرتبطة بالجزء العلوي من عظم الفخذ.

لمزيد من التثبيت والجفاف ، ضع الأنسجة المحصودة في أربعة بالمائة بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل الأنسجة إلى 15 في المائة من السكروز PBS واتركها تنقع عند أربع درجات مئوية طوال الليل أو حتى تستقر في المحلول. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى 30 في المائة من السكروز PBS عند أربع درجات مئوية طوال الليل أو لفترة أطول.

احتفظ بالأنسجة في الظلام قدر الإمكان أثناء هذه الحمامات. بعد ذلك ، ضع المناديل في وسط تضمين مثل OCT وقم بتقطيعها إلى قطع أصغر إذا لزم الأمر. ثم اتركهم يتأقلمون لبضع دقائق في طبق بتري صغير.

بعد ذلك ، انقلها إلى قوالب التبريد مع ما يكفي من OCT لتغطيتها. في القوالب ، قم بتوجيه أسطح التقسيم نحو الأسفل وتجنب تكوين الفقاعات. بعد ذلك ، قم بتجميد العينات في مبرد رغوي مغطى مملوء بالثلج الجاف حتى يتحول OCT إلى اللون الأبيض.

الآن ، قم بلف العينات الفردية في رقائق ملصقة ، وأغلقها في كيس بلاستيكي وقم بتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية حتى يمكن معالجتها. باستخدام GFP الموسوم ب LC3 كنظام مراسل ، لوحظ تحريض الالتهام الذاتي في الفئران التي تمارس كما هو موصوف. بعد تحفيز الالتهام الذاتي ، تم نقل LC3 من العصارة الخلوية إلى البلعمة الذاتية في هياكل متقطعة.

لدى الفئران التي تمارس الرياضة العديد من PFP-LC3 puncta في كل من العضلات الهيكلية والقشرة الدماغية مقارنة بالفئران في حالة الراحة. أظهر تحليل اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد LC3 أن التمرين أدى بشكل كبير إلى توليد LC3-II المقترن بالدهون ، مما يشير إلى وجود زيادة في تحويل LC3-I العصاري الخلوي إلى LC3-II. بعد ذلك ، تم قياس تدهور مستقبلات البضائع الذاتية ، p62.

تسببت 90 دقيقة من نشاط جهاز المشي في تدهور أعلى ل p62 في عضلات الهيكل العظمي من حالة الراحة. تم إنقاذ هذا التأثير عن طريق حقن الكلوروكين قبل التمرين. نظرا لأن الكلوروكين مثبط للتحلل الليزوزومي ، فإن هذه البيانات تشير إلى أن الظواهر المرصودة ترجع إلى ارتفاع التدفق الذاتي بدلا من كتلة في تحلل البلعمة الذاتية.

بعد تطويرها ، كان لهذه التقنية سلائف في مجال الالتهام الذاتي لاستكشاف التأثيرات على آلية التمرين في تدهور التمثيل الغذائي والسلوكيات الحيوانية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراقبة الفئران أثناء الجري. باتباع هذا الإجراء ، توجد طرق مثل الفحص المجهري الكهربائي.

يمكن إجراء الفحص المجهري للحيوانات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التمرين في مسارات الالتهام الذاتي المختارة ، مثل الانقسام والشتمون الدهني.