تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران

الهدف العام من هذه التجربة هو تنشيط عملية الالتهام الذاتي فسيولوجياً في الفئران عن طريق الجري القسري أو الطوعي، ومن ثم قياس مستويات الالتهام الذاتي في أنسجة محددة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية حول الالتهام الذاتي، وبوجه خاص، كيف يساهم الالتهام الذاتي والنشاط البدني في الآثار المفيدة التي يتوسطها التمرين الهوائي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن التمرين البدني يعد وسيلة هوائية سريعة لتحفيز الالتهام الذاتي داخل الجسم الحي باستخدام الفئران.

لهذه التجربة، ابدأ باستخدام فئران من سلالة C57 black six تتراوح أعمارها بين ثمانية إلى اثني عشر أسبوعاً، وتحمل جيناً ناقلاً للكشف عن عملية البلعمة الذاتية المستحثة بالتمرين داخل الجسم الحي، والمعروف باسم GFP-LC3. لمزيد من التفاصيل حول استخدام أجهزة المشي الخاصة بالفئران، راجع منشور JoVE التالي. اضبط التحفيز الكهربائي لجهاز المشي على شدة منخفضة.

في الجلستين الأوليين، يتم تأقلم الفئران على جهاز سير متحرك مفتوح بميل صاعد قدره عشر درجات. وفي اليوم الأول، يتم تمرين الفئران لمدة خمس دقائق مع تشغيل جهاز السير بسرعة ثمانية أمتار في الدقيقة. وفي اليوم الثاني، يتم تشغيل الفئران لمدة عشر دقائق، بسرعة ثمانية أمتار في الدقيقة في البداية، وبعد مرور خمس دقائق، يتم رفع السرعة تدريجياً لتصل إلى عشرة أمتار في الدقيقة.

في اليوم الثالث، يتم تشغيل الفئران لمدة 90 دقيقة كاملة. ابدأ تشغيل جهاز المشي بسرعة 10 meters per minute وحفز الفئران على الركض باستخدام دفعات خفيفة لتجنب الصدمات الكهربائية المتكررة للأقدام. ومن الضروري مراقبة الفئران وتوجيهها لضمان عدم تلقيها الكثير من الصدمات الكهربائية خلال فترة الركض التي تستغرق 90 دقيقة.

طوال فترة التشغيل، استخدم أصابعك لتحفيز الفئران على البقاء فوق جهاز المشي. وبعد مرور 40 دقيقة، قم بزيادة السرعة بمقدار متر واحد في الدقيقة. وبعد 50 دقيقة، قم بزيادة السرعة مرة أخرى بمقدار متر واحد في الدقيقة.

بعد مرور 60 دقيقة، قم بزيادة السرعة بمقدار متر واحد إضافي في الدقيقة. وبعد 70 دقيقة، ابدأ بزيادة السرعة كل خمس دقائق بحيث تكون السرعة في الدقائق الخمس الأخيرة من التشغيل الذي يستغرق 90 دقيقة هي 17 متراً في الدقيقة. وبعد انتهاء التجربة، قم بقتل الفئران رحيمًا على الفور لجمع الأنسجة إذا كان ذلك مطلوباً.

بالنسبة لهذا الاختبار، يتم إيواء الفئران بشكل فردي. استخدم السلالة نفسها الموصوفة سابقاً. قم بتجهيز عجلة جري للفئران بقطر 11.4 centimeter مع مقياس مسافات دراجة متصل بها.

يجب أن تبلغ مسافة كل دورة 358 مليمتر. انقل الفأر إلى القفص الذي يحتوي على العجلة واتركه يستخدمها بحرية لمدة أسبوعين. قم بتسجيل المسافة التي قطعها الفأر من عداد المسافات كل 24 ساعة.

بعد مرور أسبوعين، يتم جمع الأنسجة للتحليل حسب الحاجة. ولقياس التدفق الالتهامي، يتم علاج الفئران بمثبط الالتهام الذاتي، الكلوروكين، لمدة ثلاثة أيام. يُذاب الكلوروكين في PBS بتركيز 5 mg/mL ويُحقن في الفئران داخل الصفاق بجرعة 50 µg/g.

أعطِ الفئران حقنة واحدة يومياً لمدة ثلاثة أيام متتالية، واجمع الأنسجة بعد ثلاث ساعات من الحقنة الأخيرة. بالنسبة للفئران التي خضعت للتمرين على جهاز المشي، ابدأ الجري لمدة 90 دقيقة بعد 90 دقيقة من الحقنة في اليوم الثالث، بحيث ينتهي الجري بعد ثلاث ساعات من الحقنة. ثم قم بقصى الفئران وارحمها (Euthanize) واجمع أنسجتها على الفور.

استعد لإجراء التروية للحيوان في غضون 90 دقيقة من ممارسة التمرين عن طريق تحضير المثبت. املأ سرنجة سعة 30 milliliter بـ 15 إلى 20 milliliters من البارافورمالدهيد بتركيز 4% المُحضّر حديثًا، ثم صِل السرنجة بإبرة قسطرة عيار 20 gauge. ركّب مضخة السرنجة المعبأة واضبطها على تدفق مستمر بمعدل 90 milliliters في الساعة.

مع وضع الحيوان على سطح عمل نظيف وفي وضعية الاستلقاء الظهري، قم بفتح التجويف الصدري عبر الحجاب الحاجز للكشف عن القلب. الآن، أدخل إبرة القسطرة في البطين الأيمن. بعد ذلك، قم بعمل شق صغير في الكبد لتصريف الدم وقم بتشغيل المضخة.

احقن المثبت حتى تصبح الرئة والكبد شاحبتين تماماً. عادةً ما تكفي 15 milliliters من المثبت. بعد عملية التروية، قم بإزالة الإبرة وجمع الأنسجة المستهدفة.

لجمع العضلات الهيكلية، قم بتشريح العضلة المتسعة الوحشية. اسحب جلد الساق للخلف قليلاً للكشف عن العضلات وتحديد موقع العضلة رباعية الرؤوس الفخذية. بعد ذلك، قم بتشريح العضلة المتسعة الوحشية، وهي العضلة الخارجية المتصلة بالجزء العلوي من عظمة الفخذ.

لمزيد من التثبيت وإزالة الماء، ضع الأنسجة التي تم حصادها في بارافورمالدهيد بنسبة 4% لمدة 24 ساعة عند 4 °C. وفي اليوم التالي، انقل الأنسجة إلى محلول PBS يحتوي على سكروز بنسبة 15% واتركها منقوعة عند 4 °C طوال الليل أو حتى تستقر في المحلول. بعد ذلك، انقل الأنسجة إلى محلول PBS يحتوي على سكروز بنسبة 30% عند 4 °C طوال الليل أو لفترة أطول.

احتفظ بالأنسجة في الظلام قدر الإمكان خلال هذه الحمامات. بعد ذلك، ضع الأنسجة في وسط تضمين مثل OCT وقطعها إلى قطع أصغر إذا لزم الأمر. ثم، اتركها تتأقلم لبضع دقائق في طبق بتري صغير.

بعد ذلك، يتم نقلها إلى قوالب التجميد (cryomolds) مع إضافة كمية كافية من مركب OCT لتغطيتها. وفي القوالب، يتم توجيه أسطح التقطيع نحو الأسفل مع تجنب تكوين فقاعات. ثم تجمّد العينات في مبرد رغوي مغطى مملوء بالثلج الجاف حتى يتحول لون OCT إلى الأبيض.

الآن، قم بتغليف العينات الفردية برقائق ألومنيوم مصنفة، وأغلقها في كيس بلاستيكي واحفظها عند درجة حرارة 80- °C حتى يحين وقت معالجتها. وباستخدام LC3 المسمى بـ GFP كنظام مراسل، لوحظ تحفيز عملية الالتهام الذاتي في الفئران التي مارست التمارين كما هو موضح. وبعد تحفيز الالتهام الذاتي، انتقل LC3 من العصارة الخلوية إلى الجسيم البلعمي الذاتي في شكل هياكل منقطة.

أظهرت الفئران التي خضعت للتمرين وجود عدد أكبر بكثير من نقاط GFP-LC3 في كل من العضلات الهيكلية والقشرة الدماغية مقارنة بالفئران في حالة الراحة. وأظهر تحليل لطخة ويسترن (Western blot) باستخدام جسم مضاد لـ LC3 أن التمرين حفز بشكل ملحوظ تكوين LC3-II المقترن بالدهون، مما يشير إلى زيادة تحول LC3-I السيتوبلازمي إلى LC3-II. بعد ذلك، تم قياس تحلل مستقبل حمولة الالتهام الذاتي، p62.

أدى النشاط على جهاز المشي لمدة 90 دقيقة إلى تحلل p62 في العضلات الهيكلية بشكل أكبر مما حدث في حالة الراحة. وقد تم عكس هذا التأثير عن طريق الحقن بـ chloroquine قبل التمرين. وبما أن chloroquine يعمل كمثبط للتحلل الليزوزومي، فإن هذه البيانات تشير إلى أن الظاهرة الملحوظة تعود إلى ارتفاع تدفق الالتهام الذاتي بدلاً من وجود حصار في تحلل الأجسام البلعمية الذاتية.

بعد تطويرها، كان لهذه التقنية سلائف في مجال الالتهام الذاتي لاستكشاف التأثيرات على آلية التمرين في تحلل التمثيل الغذائي وسلوكيات الحيوان. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراقبة الفئران أثناء الركض. وتلي هذا الإجراء طرق مثل المجهر الإلكتروني.

يمكن إجراء الفحص المجهري للحيوانات للإجابة على أسئلة إضافية مثل دور التمرين الرياضي في مسارات الالتهام الذاتي المختارة، مثل الميتوفاجي (mitophagy) والليبوفاجي (lipophagy).