صورة موجهة، التصنيع القائم على الليزر من شبكات ميكروفلويديك المستمدة الأوعية الدموية.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف كيفية استخدام مجهر متحد البؤر مزود بليزر نبضي فيمتو ثانية لتوليد شبكات ميكروميدات ميكروميكروية مشتقة من الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد مدمجة في الهلاميات المائية البولي إيثيلين جلايكول دياكريلات باستخدام التحلل القائم على الليزر الموجه بالصور. تتمثل إحدى المزايا المهمة لهذه التقنية في القدرة على إنشاء شبكات موائع دقيقة ثلاثية الأبعاد للمحاكاة الحيوية تلخص بدقة الكثافة والالتواء ونطاق الحجم والهندسة المعمارية الشاملة للأوعية الدموية في الجسم الحي في التركيبات الاصطناعية. سيعزز نهج تصنيع الموائع الدقيقة هذا قدرتنا على توليد المزيد في الجسم الحي مثل التركيبات الهندسية للأنسجة ، ونماذج الأمراض المقلدة الحيوية ، والكثافة العالية للغاية على أجهزة الرقاقة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الإعداد والتنفيذ المناسبين لبرنامج المجهر ليس بديهيا ، ولكنه أمر بالغ الأهمية في تشكيل شبكات الموائع الدقيقة المطلوبة. يتم تغطية العديد من الخطوات التحضيرية في بروتوكول النص ، بما في ذلك إنشاء الأقنعة الافتراضية ، وتكوين المجهر ، وتحميل الأقنعة الافتراضية إلى برنامج المجهر. لبلمرة الهيدروجيل PEGDA الضوئي ، قم أولا بإرفاق حلقة من المادة اللاصقة على الوجهين بطبق بتري مقاس 60 ملم به ثقب 20 ملم مقطوع من الأسفل.

بعد ذلك ، في غطاء الدخان ، أضف ملليلترا واحدا من HBS مع TEOA إلى أنبوب طرد مركزي كهرماني مغطى بملليلتر. ثم أضف 10 ميكرولتر من ملح ثنائي الصوديوم المليمول Eosin Y إلى الأنبوب. الآن ، قم بإدخال كمية صغيرة من NVP في دورق زجاجي باستخدام ماصة زجاجية.

من هذا الحجم ، خذ 3.5 ميكرولتر من NVP وانقله إلى الخليط. بعد ذلك ، أضف 10 ملليغرام من 3.4 كيلودالتون PEGDA إلى أنبوب ثان مغطى بورق الألمنيوم. ثم أضف 0.2 مل من الخليط لعمل 5٪ من الوزن من حيث الحجم محلول PEGDA prepolymer.

الآن ، قم بتدوير محلول البوليمر المسبق حتى يذوب PEGDA تماما. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 60 ميكرولترا على قالب PDMS دون إدخال أي فقاعات. الآن ، قم بتوسيط غطاء زجاجي مقاس 40 ملم رقم 1.5 فوق المحلول على فواصل PDMS.

ثم ضع المجموعة تحت مصدر ضوء أبيض تمت معايرته لتوصيل 95 مللي واط. عالج البوليمر لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بتدفق الماء المقطر بين القالب والغطاء لفصل الهيدروجيل عن PDMS وشطف الهيدروجيل.

بعد ذلك ، جفف حواف الغطاء بعناية دون امتصاص الماء من الهيدروجيل. الآن ، قم بلصق الغطاء على طبق بتري المجهز. القليل من الضغط يساعد.

ثم اغمر الهيدروجيل في الماء المقطر. قم بإعداد المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر كما هو موضح في بروتوكول النص وابدأ في تكوين تصور الهيدروجيل. بعد ذلك ، ضع طبق الهيدروجيل والبتري في إدراج المسرح وضعه على المسرح.

بعد ذلك ، املأ طبق بتري بما لا يقل عن خمسة ملليلتر من الماء المقطر وقم بخفض هدف الغمر في الماء إلى أعلى الهيدروجيل مباشرة دون ملامسته. الآن ، انقر فوق مباشر لتشغيل خط ليزر الأرجون. بعد ذلك ، ركز على الهيدروجيل حتى يمكن رؤية إشارة Eosin Y على الجانب العلوي من الهيدروجيل.

للمساعدة في العثور على الهيدروجيل ، حاول زيادة النسبة المئوية للطاقة أو حجم الثقب مؤقتا. حدد مواقع الجزء العلوي والسفلي من الهيدروجيل وقاع البئر. ثم استخدم عصا التحكم للتحرك بشكل عرضي والعثور على حواف البئر.

في نافذة التركيز البؤري ، قم بإسقاط مستوى التركيز لأسفل 150 ميكرون داخل الهيدروجيل باستخدام السهم لأسفل بجوار مربع الموضع Z. الخطوة التالية حاسمة. قم بتصفير موقع X و Y في نافذة المرحلة ، ثم احذف جميع المواقع الأخرى المحددة وحدد الموقع الذي تم تصفيره فقط.

الآن ، لبدء عملية تشكيل قناة مدخل ، قم أولا بالتقاط صورة ثم باستخدام زر المستطيل في نافذة المناطق ، حدد المنطقة التي ستكون مدخل شبكة الأوعية الدموية. ثم انتقل إلى تكوين تكوين القناة. وترد التفاصيل في بروتوكول النص.

بمجرد الوصول إلى هناك ، في نافذة مكدس Z ، انقر فوق الأزرار المركزية في أعلى وإزاحة أعلى لتوسيط مكدس Z في الموضع الحالي. ثم اعتمادا على حجم المدخل ، قم بتعيين عدد الشرائح بفاصل زمني واحد. الآن ، تأكد من ضبط السرعة على ثلاثة وأن النسبة المئوية للطاقة مضبوطة على 100.

ثم تابع حفظ التكوين وانقر فوق الزر بدء التجربة. لتصور الهيدروجيل أثناء تدهور القناة ، قم إما بزيادة سيد الكسب في نافذة القنوات إذا كانت المنطقة في مجال الرؤية سوداء ، أو قم بتقليل سيد الكسب إذا كانت المنطقة بيضاء. بعد التدهور ، تأكد من تشكيل المدخل من خلال العودة إلى تكوين تصور الهيدروجيل والنقر فوق البث المباشر.

أولا ، ضمن نافذة المناطق ، قم بتحميل أي ملف ovl من مكدس Z للأقنعة الافتراضية وانقر فوق زر السهم لرؤية عائد الاستثمار في مجال العرض. بعد ذلك ، انقر فوق مباشر لمسح تكوين تصور الهيدروجيل واستخدم عصا التحكم أو نافذة المسرح لوضع الهيدروجيل بحيث يتصل المدخل بالموقع الصحيح داخل شبكة الأوعية الدموية. بعد ذلك ، قم بإسقاط مستوى التركيز إلى الموضع الأول في ماكرو المجهر الذي يقع على بعد 50 ميكرون من موقع Z المركزي السابق باستخدام حجم الخطوة في نافذة التركيز والنقر فوق السهم لأسفل.

مرة أخرى ، من الأهمية بمكان الآن إعادة تصفير موقعي X و Y ، وحذف جميع المواقع الأخرى المحددة ، ووضع علامة على هذا الموقع فقط كنقطة الصفر الجديدة. تأكد من حفظ هذا التكوين الجديد. الآن ، ضمن تكوين تكوين القناة ، حدد فقط السلسلة الزمنية ونوافذ التبييض.

بعد ذلك ، افتح الماكرو وحدد علامة التبويب الحفظ. حدد الوصفة التي تم إعدادها مسبقا وانقر فوق تطبيق. تأكد من عدم النقر فوق المتجر ، وإلا سيتم استبدال الوصفة.

بعد التحقق من الإعدادات، احفظ تكوين تكوين القناة مرة أخرى ثم انقر فوق تحديث في ماكرو المجهر. انقر فوق لا للكتابة فوق قائمة المواقع الحالية، ثم انقر فوق ابدأ في ماكرو المجهر لبدء الوصفة. بعد اكتمال عملية التحلل ، استخدم تكوين تصور الهيدروجيل بطاقة ليزر أقل لتمكين عرض ديكستران المسمى FITC ، والذي يحتوي على إشارة أكثر إشراقا من إشارة Eosin Y الأصلية للهيدروجيل.

قبل إدخال ديكستران المسمى بالفلورسنت ، قم بإخراج بعض الماء من البئر في الهيدروجيل. ثم ماصة في 10 ميكرولترات من ديكستران المصفى المسمى FITC. تم استخدام الإجراء الموصوف لتحويل حجم كبير من صور الأوعية الدموية الدقيقة إلى سلسلة من الأقنعة الافتراضية لتشكيل شبكة الموائع الدقيقة الموجهة بالصور.

تمت مقارنة شبكة الموائع الدقيقة الناتجة مع الأوعية الدموية في الجسم الحي التي اشتقت منها. مكن تحلل الهيدروجيل القائم على الليزر الموجه بالصورة من تصنيع شبكات الموائع الدقيقة ثلاثية الأبعاد المقلدة الحيوية التي تلخص الحجم والالتواء والهندسة المعمارية المعقدة للأوعية الدموية في الجسم الحي. تم استخدام كل من رؤوس الضغط ومضخات الحقن لبدء تدفق السوائل في شبكات الموائع الدقيقة المدمجة.

لوحظ أن حبات البوليسترين المسماة بالفلورسنت 70 كيلودالتون و 10 ميكرون من البوليسترين تتحرك من اليسار إلى اليمين عن طريق تدفق مستحث برأس الضغط. بدلا من ذلك ، بدأ التدفق المدفوع بمضخة الحقنة عن طريق بلمرة ضوئية هيدروجيل داخل جهاز ميكروفيليديك ثانوي. باستخدام نفس البروتوكول الموضح هنا ، تم بعد ذلك تنفيذ التحلل القائم على الليزر لتصنيع شبكة مشتقة من الأوعية الدموية ثنائية الأبعاد في هيدروجيل موجود للتدفق المدفوع بمضخة الحقنة ووفرة 65 كيلودالتون ديكستران.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المجهز بليزر نبضي فيمتو ثانية لتوليد شبكات الموائع الدقيقة المقلدة بيوميميتا باستخدام تحلل الهيدروجيل القائم على الليزر الموجه بالصور. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن معلمات الليزر بما في ذلك الطاقة والطول الموجي وسرعة المسح تحتاج إلى تعديل وتحسين بناء على تركيبة الهيدروجيل التي تتحلل.

شكرا لك ونتمنى لك السعادة في تجاربك.