تصوير العدلات يبلوع والسيتوبلازم باستخدام الرقم الهيدروجيني المؤشر Ratiometric

توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة لقياس درجة الحموضة phagosomal والمنطقة وكذلك درجة الحموضة هيولي العدلات الإنسان والفأر باستخدام مؤشر ratiometric seminaphthorhodafluor (SNARF) -1، أو S-1. ويتحقق ذلك باستخدام خلايا الحية متحد البؤر المجهري مضان وتحليل الصور.

الهدف العام من تقنية الفحص المجهري متحد البؤر هذه هو تصوير درجة الحموضة ومساحة الفجوة البلعمية والعدلات والسيتوبلازم. تتيح هذه الطريقة مراقبة وقياس التغيرات الديناميكية في الأس الهيدروجيني في الفجوة البلعمية وفي السيتوبلازم ، وكذلك حجم الفجوة البلعمة. تتغير هذه القياسات مع نشاط NADPH oxidase ، ويمكن استخدامها كعلامات بديلة لوظيفتها وتدفقات الأيونات عبر غشاء الفجوة البلعمة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصوير كل من البلعمة والسيتوبلازم في وقت واحد باستخدام صبغة ذات نطاق واسع من الأس الهيدروجيني. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد كمية من إستر الكربوكسي S-1 السكسينيميديل عن طريق تخفيف 50 ميكروغرام منه في 100 ميكرولتر من DMSO عالي الجودة. دوامة جيدا للخلط.

بعد ذلك ، قم بإعداد مليلتر واحد في 10 إلى الحرارة الثامنة المقتولة أو HK Candida في 0.1 مولار بيكربونات الصوديوم في أنبوب 15 ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من الكربوكسي S-1 قطرة واحدة في كل مرة إلى HK Candida أثناء الخلط على دوامة بسرعة 2,000 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، لف الأنبوب بورق الألمنيوم وضعه على أسطوانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد ساعة ، اغسل HKC-S-1 ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عند 2 ، 250 مرة جم لمدة 10 دقائق في كل مرة. في أول غسلتين ، أعد تعليق الحبيبات في 15 مل من بيكربونات الصوديوم 0.1 مولار. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليقه في مليلتر واحد من المخزن المؤقت BSS.

انقل تعليق HKC-S-1 إلى أنابيب سعة 100 ميكرولتر وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لمعالجة HKC-S-1 للعدلات البشرية ، أضف 100 ميكرولتر من مصل IGG البشري إلى 100 ميكرولتر من HKC-S-1 المذاب. امزجها على شاكر حراري على حرارة 37 درجة مئوية و 1 ، 1000 دورة في الدقيقة لمدة 60 إلى 90 دقيقة ، ثم على بكرة ، على أربع درجات مئوية لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، اغسل العينة ثلاث مرات في المخزن المؤقت BSS عن طريق الطرد المركزي عند 17 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة لكل منهما. بعد ذلك ، أعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت BSS. بالنسبة لعدلات الدم المحيطي البشري ، خذ 15 مل من الدم عن طريق بزل الوريد من متبرع سليم ونقله إلى حقنة سعة 20 مليلتر تحتوي على 90 ميكرولتر من محلول الهيبارين الصوديوم بمعدل 1000 وحدة دولية لكل مليلتر.

باستخدام طرف الماصة، قم بحقن 1.5 مل من محلول ديكستران بنسبة 10٪ في المحقنة. اقلبها برفق ثلاث مرات ثم اتركها واقفة منتصبة على المقعد لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد 30 إلى 60 دقيقة ، يجب أن ينقسم الدم تقريبا إلى نصفين ، مع طبقة طبقة علوية من القش وطبقة سفلية تحتوي على كريات الدم الحمراء.

ادفع الطبقة العليا بحذر من خلال إبرة أو قم بإزالتها بطرف ماصة ، ثم انقلها إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وتجنب إخراج الطبقة الحمراء. باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر، أضف ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة إلى قاع الأنبوب، أسفل طبقة الطبقة المصفرية، للحصول على طبقتين متميزتين. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 900 مرة جم لمدة 10 دقائق.

اسكب المادة الطافية واترك الحبيبات الحمراء خلفها. بعد ذلك ، دوامة برفق لإزعاج الحبيبات. بعد ذلك, أضف سبعة ملليلتر من الماء المقطر المعقم إلى الحبيبات واقلبها لمدة 20 ثانية لإعادة تعليق الحبيبات.

بعد ذلك ، أضف سبعة ملليلتر من محلول ملحي 2x واقلبه عدة مرات للخلط ، مع تحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية ، ثم الطرد المركزي للعينة عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت BSS إلى ما يقرب من أربعة أضعاف 10 إلى السادس لكل مليلتر. في هذا الإجراء ، قم بمعالجة لوحة الفحص المجهري المكونة من ثمانية آبار مسبقا ب 200 ميكرولتر من بولي إل ليسين في كل بئر لمدة 40 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة بولي إل ليسين وغسل الآبار مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء المقطر.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضر إلى كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد كمية من إستر S-1-AM عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من DMSO عالي الجودة إلى أنبوب ودوامة للخلط. في أنبوب صغير ، أضف 1.7 مل من المخزن المؤقت BSS و 20 ميكرولترا من S-1-AM وقم بتدوير الخليط.

بعد ذلك ، اغسل الآبار مرتين ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت BSS واستبدل المخزن المؤقت بمحلول S-1-AM. احرص على عدم إزعاج طبقة الخلية أحادية التعلق بقاع البئر عن طريق سحب السائل برفق أسفل جدار الآبار. بعد ذلك ، احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة على الأقل.

بعد ذلك ، اغسل الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من BSS المخزن المؤقت. لاختبار مثبط ، قم بتكوين مزيج رئيسي من الدواء المناسب في BSS المؤقت واغسل الآبار مرتين به. بعد ذلك ، قم بصوتنة HKC-S-1 المضادة للصوت لمدة ثلاث ثوان تقريبا عند خمسة ميكرون وأضف 10 ميكرولتر منه إلى كل بئر ، ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة ، مما يجعل الخلايا جاهزة للتصوير للحصول على لقطات من البلعمة.

باستخدام المجهر متحد البؤر ، اضبط الطول الموجي لليزر بحيث يتم إثارة الخلايا عند 555 نانومتر ويتم اكتشاف الانبعاث بواسطة كاشفين من 560 إلى 600 نانومتر ، وأكثر من 610 نانومتر. بعد ذلك ، اعرض الخلايا باستخدام عدسة غمر بالزيت 63X. استخدم صورة مسح ضوئي للجانب في الإعداد المستمر لعرض اللوحة المركزية.

باستخدام شدة التألق وكسب قنوات الكاشف ، اضبط تركيز الليزر وشدته وكسب القناتين لتحسين الصورة. بعد ذلك ، قم بتقسيم الصورة باستخدام الإعدادات لعرض كلتا القناتين. قبل بدء التجربة ، تأكد من عدم وجود تشبع لشدة التألق في السيتوبلازم أو الفجوات ، والتي قد تظهر على شكل نقاط حمراء.

إذا كان الأمر كذلك ، فقم بتقليل شدة الليزر بحيث يكون هناك عدد ضئيل من النقاط الحمراء ، لكن الخلايا والبلعمات ساطعة وواضحة بما يكفي لرؤيتها. في هذا الإجراء ، افتح ImageJ وقم بتحميل ملف الصورة المختار للتحليل على شريط الأدوات. للجمع بين القناتين، استخدم الصورة واللون ثم اصنع مركبا.

انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار ملف لتخزين النتائج. بعد ذلك ، انقر فوق أداة الخط على شريط الأدوات وانقر نقرا مزدوجا لزيادة العرض إلى اثنين. ارسم خطا عبر عرض البلعمة ثم انقر بزر الماوس الأيمن لقياس الرقم الهيدروجيني.

يمكن قياس درجة الحموضة السيتوبلازمية بنفس الطريقة عن طريق رسم خط عبر السيتوبلازم. بعد الانتهاء من القياسات ، انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار حفظ الملف. لقياس منطقة البلعمة، استخدم الرمز الرابع على طول شريط الأدوات للرسم يدويا حول المنطقة.

بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد قياس المنطقة. فيما يلي مفتاح مرئي نوعي للون التقريبي للبلعمات الملونة S-1 المقابلة لدرجة الحموضة. يشير اللون الأصفر إلى مزيد من الحموضة بينما يشير اللون الأحمر إلى المزيد من القلوية.

تظهر هذه الصورة عدلات النخاع المرتبطة بالفأر التي تفتقر إلى قناة Hvcn1 بعد 20 دقيقة من البلعمة. تبدو البلعمة حمراء جدا وقلوية ومنتفخة. يشير السهم الأحمر هنا إلى المبيضات داخل الخلايا ، بينما يشير هذا السهم إلى المبيضات خارج الخلية.

تظهر هذه الصورة عدلات نخاع عظم الفأر من النوع البري التي ابتلعت المبيضات. إنها أقل قلوية بكثير من العدلات بالضربة القاضية Hvcn1. تظهر هذه الصورة عدلات الدم المحيطي البشري في نفس النقطة الزمنية بعد البلعمة.

تبدو قلوية أكثر قليلا من الخلايا البرية للفأر ، لكن البلعمة لا تزال ليست كبيرة وحمراء مثل خلايا الضربة القاضية Hvcn1 ، وتظهر هذه الصورة العدلات البشرية التي قامت ببلعمة المبيضات في وجود خمسة يودونيوم ثنائي فينيلين ميكرومولار. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي أربع إلى خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر عند عزل العدلات حتى لا يتم تنشيطها.

من أجل تحديد ما إذا كانت التأثيرات التي يراها المرء على التغيرات في درجة الحموضة الفراغية أو العصارية الخلوية أو حجم الفراغ ناتجة عن التغيرات في الانفجار التنفسي ، يمكن قياس هذا الانفجار التنفسي بطرق أخرى تقيس بشكل مباشر إنتاج الجذور الحرة أو استهلاك الأكسجين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل العدلات البشرية ثم تلطيخ وتصوير البلعمة والسيتوبلازم. لا تنس أن العمل مع عينات الدم البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والملابس الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.