تصوير العدلات يبلوع والسيتوبلازم باستخدام الرقم الهيدروجيني المؤشر Ratiometric

الهدف العام من تقنية المجهر البؤري هذه هو تصوير درجة pH ومساحة الفجوة البلعمية والسيتوبلازم في الخلايا المتعادلة. تتيح هذه الطريقة مراقبة وقياس التغيرات الديناميكية في درجة pH داخل الفجوة البلعمية وفي السيتوبلازم، وكذلك حجم الفجوة البلعمية. وتتغير هذه القياسات مع نشاط NADPH oxydase، ويمكن استخدامها كمؤشرات بديلة لوظيفته ولتدفقات الأيونات عبر غشاء الفجوة البلعمية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تصوير كل من الجسيم البلعمي والسيتوبلازم في آن واحد باستخدام صبغة ذات نطاق pH واسع. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير كمية محددة من carboxy-S-1 succinimidyl ester عن طريق تخفيف 50 micrograms منه في 100 microliters من DMSO عالي الجودة. استخدم جهاز vortext لخلطه جيداً.

بعد ذلك، قم بتحضير واحد ملليليتر من فطر Candida المقتول حرارياً (HK) بتركيز 10⁸ في 0.1 مولار من بيكربونات الصوديوم في أنبوب سعة 15 ملليليتر. أضف 100 ميكرولتر من carboxy-S-1 تدريجياً (قطرة تلو الأخرى) إلى HK Candida مع الخلط باستخدام جهاز Vortex بسرعة 2,000 RPM. بعد ذلك، قم بلف الأنبوب بورق ألومنيوم وضعه على جهاز دحروجة (roller) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد مرور ساعة، اغسل خلايا HKC-S-1 ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عند 2,250 ×g لمدة 10 دقائق في كل مرة. بالنسبة لعمليتي الغسل الأوليين، أعد تعليق الراسب في 15 milliliters من بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.1 molar. وبعد الغسلة الثالثة، أعد تعليقه في one milliliter من محلول BSS buffer.

انقل معلق HKC-S-1 إلى أنابيب في حصص تبلغ 100 µL وخزنها عند -20 °C. ولعمل عملية الطلاء (opsonization) لـ HKC-S-1 لجذب العدلات البشرية، أضف 100 µL من مصل IGG البشري إلى 100 µL من HKC-S-1 المذاب. اخلط المزيج على هزاز حراري عند 37 °C وبسرعة 1,000 RPM لمدة تتراوح بين 60 و90 دقيقة، ثم على أسطوانة تدوير (roller) عند 4 °C لمدة ساعتين.

بعد ذلك، اغسل العينة ثلاث مرات في محلول BSS المنظم عن طريق الطرد المركزي بسرعة 17,000 ×g لمدة دقيقة واحدة في كل مرة. لاحقاً، أعد تعليق العينة في 100 µL من محلول BSS المنظم. وبالنسبة للخلايا المتعادلة في الدم المحيطي البشري، خذ 15 mL من الدم عن طريق سحب وريدي من متبرع سليم وانقله إلى حقنة سعة 20 mL تحتوي على 90 µL من محلول هيبارين الصوديوم بتركيز 1,000 IU لكل mL.

باستخدام رأس ماصة، احقن 1.5 milliliters من محلول dextran بتركيز 10% في المحقنة. اقلبها بلطف ثلاث مرات ثم اتركها قائمة على المنضدة لمدة تتراوح بين 30 و 60 دقيقة. بعد مرور 30 إلى 60 دقيقة، يجب أن ينفصل الدم تقريباً إلى نصفين، بحيث تتكون طبقة علوية من الغشاء البلدي (buffy coat) ذات لون قشي، وطبقة سفلية تحتوي على erythrocytes.

ادفع الطبقة العلوية بعناية للخارج باستخدام إبرة أو أزلها بواسطة طرف ماصة، ثم انقلها إلى أنبوب سعة 15 milliliter مع تجنب سحب الطبقة الحمراء. وباستخدام ماصة سعة خمسة milliliter، أضف من ثلاثة إلى أربعة milliliters من وسط تدرج الكثافة إلى قاع الأنبوب، أسفل طبقة الغشاء الكريمي (buffy coat)، للحصول على طبقتين متمايزتين. بعد ذلك، قم بЦентrifugation للعينة عند 900 ×g لمدة 10 دقائق.

قم بسكب supernatant واترك الراسب الأحمر. بعد ذلك، استخدم جهاز vortex بلطف لتفكيك الراسب. ثم، أضف سبعة مليلترات من الماء المقطر والمعقم بجهاز autoclave إلى الراسب وقم بقلب الأنبوب لمدة 20 ثانية لإعادة تعليق الراسب.

بعد ذلك، أضف سبعة ملليمترات من المحلول الملحي 2x واقلب الأنبوب عدة مرات للمزج، وذلك لتحليل ما تبقى من خلايا الدم الحمراء، ثم قم بمركزة العينة عند 300 ×g لمدة خمس دقائق. صب الراشح وأعد تعليق الراسب في منظم BSS بتركيز يصل إلى 4 × 10⁶ لكل ملليلتر تقريبًا. في هذا الإجراء، قم بمعالجة مسبقة لصفيحة مجهرية ذات ثماني آبار بإضافة 200 ميكرولتر من poly-L-lysine في كل بئر لمدة 40 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم أزل poly-L-lysine واغسل الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من الماء المقطر.

بعد ذلك، أضف 200 µL من معلق الخلايا المُحضّر إلى كل بئر، ثم قم بتحضينه في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحضير جزء من S-1-AM ester عن طريق إضافة 100 µL من DMSO عالي النقاوة إلى أنبوب، ثم استخدم جهاز vortex للمزج. وفي أنبوب صغير، أضف 1.7 mL من BSS buffer و 20 µL من S-1-AM، ثم قم بمزج الخليط باستخدام جهاز vortex.

بعد ذلك، اغسل الآبار مرتين باستخدام 200 µL من محلول BSS المنظم واستبدل المحلول بمحلول S-1-AM. احرص على عدم تعريض الطبقة الخلوية الأحادية الملتصقة بقاع البئر للاضطراب عن طريق سحب السائل برفق على طول جدار الآبار. بعد ذلك، حضّن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة على الأقل.

بعد ذلك، اغسل الآبار مرتين باستخدام 200 µL من محلول BSS المنظم. لاختبار مثبط، قم بتحضير خليط رئيسي من العقار المناسب في محلول BSS المنظم واغسل الآبار به مرتين. بعد ذلك، قم بمعالجة HKC-S-S-1 المبطن بالجسيمات المناعية بجهاز السونيكيت لمدة ثلاث ثوانٍ تقريبًا عند 5 microns وأضف 10 µL منه إلى كل بئر، ثم حضّن الطبق عند 37 °C لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة، وذلك لتجهيز الخلايا للتصوير من أجل أخذ لقطات لعملية البلعمة.

باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope)، قم بضبط الطول الموجي لليزر بحيث يتم استثارة الخلايا عند 555 نانومتر، ويتم رصد الانبعاث بواسطة كاشفين عند 560 إلى 600 نانومتر، وعند أكثر من 610 نانومتر. بعد ذلك، قم بفحص الخلايا باستخدام عدسة غمر زيتية بقوة تكبير 63X. استخدم خاصية المسح المقطعي (tile scan) على الإعداد المستمر لعرض المربع المركزي.

باستخدام شدة الفلورة وكسب قنوات الكاشف، قم بضبط تركيز وشدة الليزر وكسب القناتين لتحسين الصورة. بعد ذلك، قم بتقسيم الصورة باستخدام الإعدادات لعرض كلتا القناتين. وقبل بدء التجربة، تحقق من عدم وجود تشبع في شدة الفلورة في السيتوبلازم أو الفجوات، والذي سيظهر على شكل نقاط حمراء.

إذا كان الأمر كذلك، قلل من شدة الليزر بحيث يكون عدد النقاط الحمراء في حده الأدنى، مع بقاء الخلايا والجسيمات البلعمية ساطعة وواضحة بما يكفي لرؤيتها. في هذا الإجراء، افتح برنامج ImageJ وقم بتحميل ملف الصورة المختار للتحليل على شريط الأدوات. لدمج القناتين، استخدم Image ثم Color ثم Make Composite.

انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار ملف لتخزين النتائج. بعد ذلك، انقر على أداة الخط (Line Tool) في شريط الأدوات وانقر نقرًا مزدوجًا لزيادة العرض إلى اثنين. ارسم خطًا عبر عرض الجسيم البلعمي (phagosome) ثم انقر بزر الماوس الأيمن لقياس pH.

يمكن قياس درجة الحموضة (pH) في السيتوبلازم بنفس الطريقة عن طريق رسم خط عبر السيتوبلازم. وبعد الانتهاء من القياسات، انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار حفظ الملف (Save File). ولقياس مساحة الجسيم البلعمي، استخدم الأيقونة الرابعة الموجودة في شريط الأدوات للرسم الحر حول المنطقة.

بعد ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار قياس المساحة (Measure Area). إليك مفتاح بصري نوعي للألوان التقريبية للأجسام البلعمية المصبوغة بـ S-1 والمقابلة لـ pH؛ حيث يشير اللون الأصفر إلى زيادة الحمضية، بينما يشير اللون الأحمر إلى زيادة القلوية.

توضح هذه الصورة خلايا متعادلة من نخاع العظم للفئران التي تفتقر إلى قناة Hvcn1 بعد 20 دقيقة من عملية البلعمة. تظهر الجسيمات البلعومية باللون الأحمر القوي، وهي قلوية ومتورمة. يشير السهم الأحمر هنا إلى فطر Candida داخل الخلايا، بينما يشير هذا السهم إلى فطر Candida خارج الخلايا.

تظهر هذه الصورة خلايا متعادلة من نخاع عظم فأر بري قامت بابتلاع فطريات Candida. وتكون هذه الخلايا أقل قلوية بكثير من الخلايا المتعادلة التي تم تعطيل جين Hvcn1 فيها. وتظهر هذه الصورة خلايا متعادلة من الدم المحيطي البشري في نفس النقطة الزمنية بعد عملية البلعمة.

تبدو هذه الخلايا أكثر قلوية قليلاً من خلايا الفئران من النوع البري، إلا أن الجسيمات البلعمية لا تزال ليست كبيرة أو حمراء بقدر الخلايا التي تم فيها تعطيل جين Hvcn1، وتظهر هذه الصورة خلايا متعادلة البشرية التي قامت ببلعمة فطر Candida في وجود خمس ميكرومولار من diphenylene iodonium. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع إلى خمس ساعات تقريباً إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي الحذر عند عزل الخلايا المتعادلة لضمان عدم تنشيطها.

من أجل تحديد ما إذا كانت التأثيرات الملحوظة على تغيرات الأس الهيدروجيني (pH) الفجوي أو السيتوبلازمي أو حجم الفجوة ناتجة عن تغيرات في الدفق التنفسي، يمكن قياس هذا الدفق التنفسي بطرق أخرى تقيس بشكل مباشر إنتاج الجذور الحرة أو استهلاك الأكسجين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المتعادلة البشرية ثم صبغ وتصوير الجسيم البلعمي والسيتوبلازم. لا تنسَ أن العمل مع عينات الدم البشرية يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والملابس الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.