رصد مفاعليه Astrocyte والانتشار في المختبر تحت ظروف أشبه بالسكتة

يهدف البروتوكول التالي إلى إظهار عزل الخلايا النجمية الأولية عن أدمغة الفئران الجرو لأداء الحرمان من الجلوكوز بالأكسجين أو OGD. إن تعرض الخلايا النجمية المنقاة للبيئة المحرومة من الجلوكوز بالأكسجين هو وحدة تسمح لنا باختبار رد الفعل على بعض الحالات الموجودة في السكتات الدماغية الإقفارية. يمكن ملاحظة التغييرات المنهجية ، بعد التعرض للحرمان من الجلوكوز بالأكسجين وقياسها باستخدام علامات الخلايا النجمية الانتقائية مثل GFAP.

باختصار ، يمكن استخدام هذه الخلايا المعزولة المعرضة لظروف شبيهة بنقص تروية لاختبار طرق جديدة يتم تنشيطها في ظروف نقص الأكسجين والأدوية الأخرى التي تحمي من السكتة الدماغية الإقفارية. في هذا الجزء من البروتوكول ، سيتم عزل الخلايا النجمية عن قشرة الفئران الجرو. الغرض من هذا الإجراء هو الحصول على ثقافة الخلايا النجمية الأولية لإجراء تجارب الحرمان من الجلوكوز بالأكسجين.

المواد الخاصة بهذا الإجراء هي كما يلي ، الأوتوكلاف جميع المواد قبل استخدامها في هذا الإجراء. وقم بتعريض غطاء المحرك لمدة 20 دقيقة على الأقل من الأشعة فوق البنفسجية قبل بدء البروتوكول. لبدء هذا الإجراء ، قم بسحب ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسائط DME الكاملة في كل لوحة.

سيتم تقسيمها على النحو التالي ، واحد لكل دماغ فأر ، واثنان لجميع القشرة ، وثلاثة لجميع القشرة بدون السحايا. اقطع رأس الجرو بعد تطهيره بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق يبدأ من مؤخرة الرأس باتجاه الأنف.

قم بإزالة الجمجمة بالملقط المنحني واكشط المخيخ برفق ، مما يكشف القشرية. قم بإزالة الأدمغة المكشوفة بزوج من الملقط وضع الدماغ في طبق بتري الأول مع الوسائط. كرر هذه الخطوات لجميع الجراء الأخرى.

افصل نصفي الكرة المخية عن طريق التقسيم برفق على طول شق خط الوسط مع الطرف الحاد لملقط التشريح الدقيق. قشر القشرة عن طريق إزالة المادة البيضاء والحصين باستخدام الملقط بحركة قرصة ، وتركها وراءها. انقل قشور القشر إلى طبق بتري المسمى رقم اثنين.

كرر الإجراء لجميع الأدمغة التي تجمع بين جميع القشرة المقطعة في طبق بتري. رج الطبق برفق لتوزيع الوسائط بالتساوي بين جميع القشرية. استخدم مجهر التشريح لتحديد السحايا المبطنة للقشرة المقشرة.

السحايا هي طبقة شفافة رقيقة جدا يمكن التعرف عليها من خلال البحث عن الشعيرات الدموية الحمراء الصغيرة المحيطة بالأنسجة. افحص بعناية وقم بإزالة السحايا المبطنة للقشرة وتقشيرها برفق من الفصوص القشرية الفردية باستخدام ملاقط دقيقة على جانبي كل قشرة. ضع القشرة النظيفة في طبق بتري جديد يحمل رقم ثلاثة.

لتفكك الأنسجة باستخدام طريقة المعدة أو الخلاط ، اسكب القشرة النظيفة المقشرة والوسائط من طبق بتري في كيس خلاط معقم. وأضف ما يكفي من الوسائط ليصل الحجم الإجمالي للكيس إلى خمسة ملليلترات. ضع الكيس في المعدة 80 ، واترك ما يقرب من سنتيمترين من الكيس مرئيا فوق الباب المغلق.

يتم تفكك الخلية في هذه الأداة بعد 2.5 دقيقة بسرعة عالية. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تفكك الأنسجة عن طريق إغلاق الكيس المعقم وقصف الأنسجة برفق باستخدام دورق في الغطاء حتى تصبح جزيئات الأنسجة معلقة ناعمة. تأكد من استخدام قطعة قماش بين الكيس والدورق لتجنب الاحتكاك وكسر الكيس.

صب تعليق الخلية في وسط الأكمام برقم شبكي 60. صب الخلايا المفلترة في منتصف شبكة رقم 100 للسماح لها بالترشيح عن طريق الجاذبية. صب تعليق الخلية المصفى في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

بتدوير تعليق الخلية في المركز عند 200 مرة G في جهاز التوجيه المركزي ، ويفضل أن يكون ذلك باستخدام جهاز توجيه دلو متأرجح لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وتخلص منها في دورق أضف وسائط جديدة كاملة إلى لوحة الخلايا.

باستخدام ماصة مصلية ، قم بإعادة تعليق لوحة الخلايا وفصلها بحد أقصى خمسة ملليلتر من المتوسط. أضف الكمية المطلوبة من تعليق الخلية على قارورة واستكملها بالوسائط. أضف اللوحة المعلقة إلى القارورة ذات المتوسطة.

وزع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء القارورة وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تذكر تغيير الوسائط كل ثلاثة أيام. تهدف المنهجية التالية إلى حرمان الخلايا من الأكسجين والجلوكوز في بيئة خاضعة للرقابة.

الغرض من هذا النموذج هو دراسة استجابة الخلايا النجمية في حالة سكتة دماغية تشبه التروية. المواد المستخدمة في هذا الإجراء هي تطهير الوسط الخالي من الجلوكوز عن طريق إدخال ماصة مصلية متصلة بنظام الغاز. ضعي المحلول بخليط الغاز لمدة 10 دقائق بتدفق 10 إلى 15 لترا في الدقيقة.

بعد الانتهاء من 10 دقائق ، اضبط الرقم الهيدروجيني لوسط OGD على 7.4. قم بتصفية الوسط المطهر الخالي من الجلوكوز باستخدام نظام الفلتر الأنبوبي سعة 50 مل. من المهم دائما عمل وسيط OGD جديد لكل تجربة.

سيضمن ذلك تطهير الوسط من الأكسجين. قم بإزالة وسائط الخلايا النجمية واغسلها باستخدام PBS الخلوي مرتين لإزالة الجلوكوز من الخلايا. أضف وسط OGD إلى الآبار.

ضع الطبق متعدد الآبار مع فتح الغطاء داخل غرفة نقص الأكسجة. قم بتوصيل خليط الغاز بصمام المدخل واترك صمام الخروج مفتوحا. اغسل الغرفة بخليط الغاز بمعدل 10 إلى 15 لتر في الدقيقة ، لمدة خمس إلى سبع دقائق.

أوقف تدفق الغاز وأغلق المشبك أولا على صمام الخروج. ثم أغلق المشبك الموجود على أنبوب صمام مدخل الغاز. ضع الغرفة التي تعاني من نقص الأكسجين في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب في OGD.

بعد انتهاء وقت الحضانة ، استنشق وسائط OGD وأضف DMEM الكامل بعناية إلى الخلايا للحالة الطبيعية. أعد الخلايا إلى حاضنة الثقافة لمدة صفر 24 و 48 ساعة من الظروف الطبيعية. يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا النجمية عن قشر الفئران حديثي الولادة.

بعد التحقق من نقاء الثقافات الأولية ، تم إجراء تجارب OGD. في هذا النموذج الشبيه بنقص التروية ، أدى الحرمان من الجلوكوز والأكسجين إلى حدوث تغيير فولوجي أكثر تمت مراقبته بواسطة التألق المناعي باستخدام علامات نجمية مثل GFAP أو علامات الانتشار مثل PCNA. تتمثل إحدى مزايا هذا النموذج في أنه يسمح لنا بدراسة استجابة نوع خلية معين.

على الرغم من أن القيد في هذه التقنية هو عدم وجود تفاعل بين الخلايا الخلية بسبب عزل الخلايا النجمية. تتمثل إحدى الطرق الممكنة للتغلب على هذا القيد في تعريض الخلايا النجمية لوسائط الحالة من أنواع الخلايا الأخرى أو الثقافة المشتركة. باختصار ، تسمح لنا طريقة الحرمان من جلوكوز الأكسجين في نظام خلوي معزول باختبار تأثيرات الجزيئات الواقية العصبية أو السامة العصبية المختلفة بشكل مباشر.

كما أنها أداة صالحة لدراسة بيولوجيا الخلايا النجمية. أخيرا ، يضع هذا النموذج أساسا قويا لدراسة الأدوية التنموية في الظروف التجريبية باستخدام نماذج in vivo.