إينترافيتال المجهري لاستخدام المفرج المرتبطة بورم متقدم الظهرية Skinfold الدوائر النافذة في الفئران المعدلة وراثيا نيون

ويصف هذا البروتوكول التصوير إينترافيتال من الفئران المحورة وراثيا معربا عن علامات نيون خلية على حدة. تصوير إينترافيتال يوفر طريقة غير الغازية للملاحظات ذات الدقة العالية في الحيوانات الحية باستخدام windows القابلة للغرس الممكن التصور مجهرية من العمليات من خلالها. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص دراسة العمليات الطولية.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام غرفة متقدمة لطيات الجلد الظهرية لفحص تطور الأوعية الدموية المرتبطة بالورم بالتفصيل في نموذج الفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السرطان ، مثل تحسين العلاج وفهم تطور الورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن العمليات تتم دراستها في السياق الصحيح ، في الحياة الحقيقية وأنه يمكن دراسة هذه العمليات بمرور الوقت.

سيتم توضيح هذا الإجراء من قبل الدكتورة آن سينهايف ، كبيرة الباحثين في مختبري. من فأر متبرع غير معدل وراثيا ، قم بحصاد جزء من الورم غير النخر بقطر 10 مم لزرعه في حجرة النافذة الظهرية للفأر المتلقي. استخدم متبرعا طبيعيا بالفأر لورم متزاكين أو متبرعا بفأر يعاني من نقص المناعة لكسب الطعم الغريب.

يجب ألا يقل عمر الفأر المتلقي عن 12 أسبوعا ويزن عشرين جراما أو أكثر. إجراء جميع العمليات الجراحية في ظل ظروف معقمة. على سبيل المثال ، الأوتوكلاف الأدوات الجراحية ومواد الغرفة.

بعد تخدير الفأر المتلقي ، قم بإزالة الشعر من الجانب الظهري بالكامل باستخدام أداة تشذيب كهربائية ثم استخدم جل إزالة الشعر. اشطف البشرة نظيفة وجففها. أخيرا ، افرك الجلد منزوع الشعر بالإيثانول.

الآن ، ضع علامة على خط الوسط الأفقي على طول العمود الفقري. بعد ذلك ، ضع نافذة العرض على الأقل 2 مم أسفل الخط وحدد محيط النافذة على الجلد. بعد ذلك ، باستخدام مشرط ومقص ، قم بإزالة الجلد بعناية داخل الخط المحيط دون الإضرار باللفافة الأساسية.

بعد ذلك ، اسحب الطية لأعلى واستخدم مثقاب الأذن لإدخال ثقوب 1 مم على جانبي منطقة النافذة للبراغي التي تثبت النافذة في مكانها. ضع الإطار الخلفي على الماوس وقم بتأمين الإطار عن طريق وضع الصواميل على البراغي. بعد ذلك ، اسحب الجلد من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات فوق الإطار للتأكد من ملاءمته.

إذا كان الأمر كذلك ، فقم بوخز إبرة قياس 23 من خلال فتحتي الخياطة في الجزء العلوي من الإطار. قم بتأمين الإطار عن طريق شد الصواميل وتثبيتها بحاملات إبرة التثبيت ، ولا تفرط في شد الصواميل وتمنع الجلد من الالتفاف حول البراغي. بعد ذلك ، استبدل الإبر بالخيوط لتثبيت الإطار على الجلد.

الآن أدر الماوس إلى الجانب. من هذه الزاوية ، أدخل قطعة سميكة من زجاج الحشو وزجاج غطاء قياسي مقاس 12 ملم. قم بتأمين كلاهما بحلقة تثبيت بحيث تكون اللفافة محكمة على الزجاج.

الخطوة التالية هي ترطيب النافذة باستخدام 0.9٪ كلوريد الصوديوم. اترك بضع قطرات تسقط على منطقة الرؤية وامتصاص الفائض. الآن ، أسفل النافذة مباشرة ، استخدم إبرة قياس 25 مع انحناء 90 درجة لعمل جيب عميق في اللفافة يمكنه استيعاب ملليمتر مكعب من أنسجة الورم.

ثم أدخل أنسجة الورم في الجيب. أخيرا ، أغلق منطقة عرض النافذة باستخدام غطاء زجاجي قياسي مقاس 12 ملم وحلقة احتفاظ. سوف تتبدد أي فقاعات هواء في غضون ساعة.

قبل تخدير الماوس ، قم بتسخين منصة مخصصة يتم التحكم في درجة حرارتها إلى 37 درجة مئوية. بعد تخدير الماوس ، ضعه على المنصة الدافئة. قم بتركيب مخروط أنف لتوصيل الأيزوفلوران وإذا كان التقييم سيستغرق أكثر من خمس دقائق، فقم بتقديم موعد لطب العيون.

الغرفة باستخدام مسامير النافذة لحامل مخصص وتأمين الحامل على المنصة. ثم نظف النافذة الزجاجية بالماء والقطن. الآن ، في المجهر ، تحقق من تطور الأوعية الدموية في الورم باستخدام هدف 10 مرات ، تحت المجال الساطع وضوء الفلورسنت.

بعد الفحص الإجمالي ، قم بتشغيل الليزر متحد البؤر. اضبط لوحة التحكم في المجهر على كسب ذكي يبلغ 100 فولت لكل دورة. إزاحة ذكية بنسبة 10٪ لكل دورة ، وتكبير متوسط متوسط X و Y وموضع 100 ميكرون من موضع Z لكل دورة.

اضبط وضع الاستحواذ على XYZ أو XYZT. حدد دقة. اختر سرعة اكتساب تبلغ اثنين أو 400 هرتز.

اضبط الثقب على وحدة واحدة جيدة التهوية. وحدد خيار X ثنائي الاتجاه. عند تقييم الفلوروفورات المتعددة ذات النطاق الطيفي المتداخل المحتمل ، حدد المسح المتسلسل بين الإطارات لمنع النزيف وتعيين مسارات الحزمة الصحيحة.

اضبط متوسط الخط على أربعة وأخيرا ، حدد مجموعة بيانات جديدة للتجربة. الآن ، ركز على الأنسجة التي تهمك القيام بذلك ، فمن الأفضل استخدام العدسات الجافة ذات الفتحات العددية الأعلى. بعد ذلك ، استخدم الفحص المباشر السريع للحصول على أفضل نسبة إشارة ممكنة إلى الضوضاء عن طريق ضبط الكسب والإزاحة إلى حيث لا يوجد تعريض ضوئي مفرط.

الآن ، حدد مكدس Z في علامة التبويب اكتساب. قم بإجراء مسح Z سريع. من الفحص السريع ، حدد مواضع البداية والنهاية للفحص الكامل.

بعد ذلك ، اضبط حجم الخطوة Z وفقا لحجم الثقب واستمر في الفحص الكامل. تم تصوير الفئران المضيفة التي تعبر عن ملصقات الفلورسنت بعد زرع الورم باستخدام البروتوكول الموصوف. يعبر ملصق eNOStag-GFP في Golgi وغشاء الخلية للخلايا البطانية.

يعبر ملصق ROSAmT / mG عن الإزهار الأحمر في كل مكان والإزهار الأخضر في الخلايا التي تعبر عن Cre Recombinase. أحد تطبيقات هذه التقنية هو دراسة تطور الأوعية الدموية حيث تظهر جميع المراحل في الأورام. على سبيل المثال ، يمكن رؤية الجبهات البطانية تنبت في المناطق غير الوعائية.

تسببت الأورام أيضا في تلف الأوعية الدموية وأنشأت أسرة وعائية ذات أوعية متفرعة ناضجة. تطبيق آخر هو دراسة تكوين التجويف وتدفق الدم والتسرب عن طريق تطبيق الملصقات على الدم ، مثل الجسيمات النانوية التي تتألق. وبالتالي ، يمكن ملاحظة تدفق الدم في تجويف الأنابيب الوعائية وبالقرب من خلايا الطرف البطاني.

في الخلايا الطرفية ، يمكن ملاحظة تكوين تجويف المخزون. يمكن أيضا استخدام الفحص المجهري داخل الحيوية للتحقق من تأثير عوامل العلاج الكيميائي. على سبيل المثال ، بعد 24 ساعة من حقن الجسيمات النانوية في eNOStag-GFP ، بقيت الجسيمات النانوية في الأوعية الدموية مع الحد الأدنى من التسرب في الخلال الخلالي للورم.

ومع ذلك ، عندما تم إعطاء الجسيمات النانوية بالاشتراك مع عامل نخر الورم ، لوحظ تسرب في الخلال الخلالي للورم. هذا دليل على زيادة توصيل الأدوية بين الأورام. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت حجرة نافذة طيات الجلد الظهرية وكيفية دراسة العمليات المتعلقة بالورم باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.