إينترافيتال المجهري لاستخدام المفرج المرتبطة بورم متقدم الظهرية Skinfold الدوائر النافذة في الفئران المعدلة وراثيا نيون

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام غرفة طية الجلد الظهرية المتقدمة لفحص تطور الأوعية الدموية المرتبطة بالأورام بالتفصيل في نموذج فأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال السرطان، مثل تحسين العلاج وفهم تطور الورم. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية دراسة العمليات في سياقها الصحيح، وفي ظروف حيوية واقعية، وبإمكانية متابعة هذه العمليات بمرور الوقت.

ستقوم الدكتورة Ann Seynhaeve، الباحثة الأقدم في مختبري، بشرح هذا الإجراء. من فأر مانح غير معدل وراثياً، يتم استئصال قطعة ورم غير نخرية بقطر 10 mm لزراعتها في غرفة النافذة الظهرية للفأر المستقبل. استخدم فأراً مانحاً طبيعياً في حالة الورم المتماثل جينياً (syngeneic)، أو فأراً مانحاً ناقص المناعة في حالة الطعم الغريب (xenograft).

يجب أن يكون عمر الفأر المستقبل 12 أسبوعًا على الأقل، وأن يزن عشرين جرامًا أو أكثر. تُجرى جميع الإجراءات الجراحية تحت ظروف معقمة؛ فعلى سبيل المثال، يتم تعقيم الأدوات الجراحية ومواد الغرفة باستخدام جهاز التعقيم بالبخار (autoclave).

بعد تخدير الفأر المستقبل، قم بإزالة الشعر من كامل الجانب الظهري باستخدام آلة تشذيب كهربائية، ثم استخدم جل إزالة الشعر. اشطف الجلد جيداً وجففه. وأخيراً، قم بفرك الجلد المزول منه الشعر بـ ethanol لتنظيفه.

الآن، حدد خطاً مركزياً أفقياً على طول العمود الفقري. بعد ذلك، ضع نافذة الرؤية على مسافة 2 mm على الأقل أسفل الخط، وحدد محيط النافذة على الجلد. بعد ذلك، وباستخدام المشرط والمقص، قم بإزالة الجلد بعناية من داخل خط المحيط دون إتلاف اللفافة الكامنة تحت الجلد.

بعد ذلك، ارفع طية الجلد واستخدم خرامة الأذن لعمل ثقوب بحجم 1 mm على جانبي منطقة النافذة من أجل البراغي التي تثبت النافذة في مكانها. ضع الإطار الخلفي على الفأر وثبته عن طريق وضع الصواميل على البراغي. بعد ذلك، اسحب الجلد لمسافة تتراوح بين اثنين إلى ثلاثة مليمترات فوق الإطار للتأكد من ملاءمته.

إذا كان الأمر كذلك، فقم بغرز إبر قياس 23 gauge عبر فتحتي الخياطة الموجودتين في الجزء العلوي من الإطار. قم بتثبيت الإطار عن طريق شد الصواميل وتثبيتها باستخدام حاملات إبر تثبيت؛ مع مراعاة عدم الإفراط في شد الصواميل لمنع الجلد من الالتفاف حول البراغي. بعد ذلك، استبدل الإبر بخيوط جراحية لتثبيت الإطار بالجلد.

الآن قم بتدوير الفأر إلى الجانب. ومن هذه الزاوية، أدخل قطعة سميكة من الزجاج الحاشي وغطاءً زجاجياً قياسياً بمقاس 12 مليمتر. ثبت كليهما باستخدام حلقة تثبيت بحيث تكون اللفافة مشدودة بإحكام مقابل الزجاج.

تتمثل الخطوة التالية في ترطيب النافذة باستخدام 0.9% sodium chloride. اترك بضع قطرات تسقط على منطقة الرؤية ثم امتص الزائد منها. الآن، وأسفل النافذة مباشرةً، استخدم إبرة بقياس 25 gauge مع ثنية بزاوية 90 درجة لعمل جيب عميق في اللفافة (fascia) يمكنه استيعاب مليمتر مكعب من نسيج الورم.

ثم أدخل نسيج الورم في الجيب. وأخيراً، أغلق منطقة نافذة الرؤية باستخدام غطاء زجاجي قياسي بحجم 12 millimeter وحلقة تثبيت. ستتلاشى أي فقاعات هوائية في غضون ساعة.

قبل تخدير الفأر، قم بتدفئة منصة مخصصة للتحكم في درجة الحرارة حتى 37 °C. بعد تخدير الفأر، ضعه على المنصة الدافئة. قم بتثبيت قناع أنفي لإيصال الإيزوفلوران، وإذا كان التقييم سيستغرق أكثر من خمس دقائق، فاستخدم مرهمًا للعين.

الآن، قم بتثبيت الغرفة باستخدام براغي النافذة في الحامل المصمم خصيصاً وثبت الحامل على المنصة. بعد ذلك، قم بتنظيف النافذة الزجاجية باستخدام الماء والقطن. الآن، ومن خلال المجهر، افحص تطور الأوعية الدموية في الورم باستخدام العدسة الشيئية بقوة 10 مرات، تحت الضوء الساطع والضوء الفلوري.

بعد الفحص العياني، قم بتشغيل ليزرات المجهر البؤري (confocal lasers). اضبط لوحة تحكم المجهر على كسب ذكي (smart gain) بمقدار 100 volts لكل دورة، وإزاحة ذكية (smart offset) بنسبة 10% لكل دورة، وتكبير متوسط للموضعين X وY، وموضع Z بمقدار 100 microns لكل دورة.

اضبط وضع الاستحواذ على XYZ أو XYZT. اختر الدقة. ثم اختر سرعة استحواذ تبلغ 2 أو 400 Hertz.

اضبط الثقب الدبوسي (pinhole) على وحدة هوائية واحدة (one airy unit). واختر خيار X ثنائي الاتجاه. عند تقييم عدة فلوروفورات ذات نطاق طيفي متداخل محتمل، اختر المسح المتسلسل بين الإطارات لمنع التداخل الطيفي (bleedthrough) واضبط مسارات الحزمة الصحيحة.

اضبط متوسط الخط على أربعة، وأخيراً، اختر مجموعة بيانات جديدة للتجربة. الآن، ركز على النسيج المستهدف، ومن الأفضل للقيام بذلك استخدام عدسات جافة ذات فتحات عددية أعلى. بعد ذلك، استخدم المسح الحي السريع للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء ممكنة من خلال ضبط الكسب والإزاحة بحيث لا يكون هناك تعريض مفرط.

الآن، حدد Z stack في علامة التبويب acquire. قم بإجراء مسح Z سريع. ومن خلال المسح السريع، حدد موضع البداية والنهاية للمسح الكامل.

بعد ذلك، قم بضبط حجم الخطوة Z وفقًا لحجم الثقب الصغير (pinhole) وابدأ عملية المسح الكامل. وتم تصوير الفئران المضيفة التي تعبر عن علامات فلورية بعد زرع الورم باستخدام البروتوكول الموصوف. وتظهر علامة eNOStag-GFP في جهاز جولجي والغشاء الخلوي للخلايا البطانية.

يُظهر وسم ROSAmT/mG تألقاً أحمر في جميع أنحاء الجسم، وتألقاً أخضر في الخلايا التي تعبر عن إنزيم Cre Recombinase. ويتمثل أحد تطبيقات هذه التقنية في دراسة تطور الأوعية الدموية حيث تظهر جميع المراحل في الأورام. فعلى سبيل المثال، يمكن رؤية الجبهات البطانية وهي تتبرعم في المناطق غير الوعائية.

تتميز الأورام أيضاً بوجود أوعية تالفة وأسِرّة وعائية مستقرة تحتوي على أوعية متفرعة ناضجة. وهناك تطبيق آخر يتمثل في دراسة تكوين اللمعة، وتدفق الدم، والترشح الوعائي عن طريق إضافة علامات إلى الدم، مثل الجسيمات النانوية الفلورية. وبذلك، يمكن ملاحظة تدفق الدم في لمعة الأنابيب الوعائية وبالقرب من الخلايا الطرفية البطانية.

في خلايا القمة، يمكن ملاحظة تكوين التجويف. كما يمكن استخدام المجهر الحيوي لدراسة تأثير العوامل الكيميائية العلاجية. على سبيل المثال، بعد مرور 24 ساعة من حقن الجسيمات النانوية في حيوان eNOStag-GFP، ظلت الجسيمات النانوية في الأوعية الدموية مع حد أدنى من الارتشاح إلى الخلال الورمي.

ومع ذلك، عندما تم إعطاء الجسيمات النانوية بالتزامن مع TNF، لوحظ حدوث ارتشاح إلى الخلال الورمي. وهذا دليل على زيادة في توصيل الدواء داخل الورم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تركيب غرفة نافذة طي الجلد الظهري وكيفية دراسة العمليات المرتبطة بالأورام باستخدام المجهر البؤري.