تحميل صبغ الكالسيوم إلى نهايات العصب الضفدع من خلال الجذع العصبي: تسجيل الكالسيوم العابر في الضفدع العصبي العضلي تقاطع

مرحبا اسمي ديمتري ساميجولين أعمل في مختبر الفيزياء الحيوية للعمليات المشبكية في معهد قازان للكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية ، الأكاديمية الروسية للعلوم. في مختبرنا ، ندرس طرقا واسعة لإشارات الكالسيوم في الوصلة العصبية العضلية. يعد التسجيل البصري أحد أكثر الطرق التي يسهل الوصول إليها لقياس المستوى المشبكي للكالسيوم

نصف هنا طريقة تحميل صبغة حساسة للكالسيوم ، من خلال جذع عصبي ، في النهايات العصبية للضفدع. أيضا ، نقدم بروتوكول قياس وتحليل عابر كبير من الكالسيوم في أطراف الضفادع. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن دراسة تأثير الأدوية النشطة على المستوى قبل المشبكي للكالسيوم أثناء النشاط المشبكي.

تحضير محلول تحميل الصبغة. صبغة الكالسيوم من فلوريسين أوريغون جرين بابتا ، تأتي في 500 ميكرولتر عن طريق كمية صغيرة 500 ميكروغرام من المسحوق. أضف 14 ميكرولترا من المحلول ، الذي يحتوي على HEPES ، إلى المسحوق.

محلول تحميل الدوامة ، وتدور لأسفل لخلط جيدا. لف القارورة بمحلول التحميل بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء. قم بتخزين محلول التحميل على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر في الفريزر.

إجراء تحميل الصبغة. تشريح عضلة الصدر الجلدية من. قم بتركيب الأنسجة المقطعة في طبق بتري مبطن بالفضة.

قم بتمديد الأنسجة بدبابيس ناعمة من الفولاذ المقاوم للصدأ. أضف محلول Ringer إلى طبق بتري. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع قطعة صغيرة ، حوالي 2 ملم من أنبوب الماصة البالغ طوله عشرة ميكرولترات من الطرف الرفيع.

قم بإعداد قطعة من البلاستيسين لتثبيت ماصة التعبئة على طبق بتري. قم بتوصيل ماصة التعبئة بحقنة بلاستيكية من خلال أنبوب سيليكون ومحولات مصنوعة من أنابيب الماصة. قم بإزالة محلول Ringer المؤقت من طبق Petri بواسطة ماصة بلاستيكية.

تحضير جاف مع حقنة. سيمنع ذلك شفط المحلول في ماصة التعبئة. قم بإزالة القارورة بمحلول التحميل من الفريزر واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم.

باستخدام ملاقط ومقص ناعم ، تحت التحكم البصري ، باستخدام مجهر معقم ، قم بقطع العصب بالقرب من العضلات. اترك حوالي ملليمترين من جذع العصب. ثبت ماصة التعبئة بأنبوب وحقنة على طبق بتري باستخدام البلاستيسين.

حركه بالقرب من فرع العصب. قم بشفط جذع العصب برفق في ماصة الحشو. قم بإزالة أنبوب الشفط من الطرف غير الحاد لماصة التعبئة.

جفف جذع العصب في ماصة التعبئة بواسطة المحقنة. حرك ماصة الحشو لأعلى باستخدام جذع العصب. عزل جذع العصب من الخارج بواسطة الفازلين.

مرة أخرى، جفف جذع العصب في ماصة الحشو بواسطة المحقنة. ارسم نقطة الصفر خمسة ميكرولترات من محلول التحميل باستخدام ماصة ذات طرف ماصة طويل. أدخل طرف الماصة برفق مع محلول التحميل في ماصة التعبئة.

أخرج الخليط مباشرة إلى جذع العصب. أغلق الطرف المفتوح لماصة التعبئة بواسطة الفازلين. أضف كمية صغيرة من المحلول إلى طبق بتري.

احتضان المستحضر في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم ورطب لمدة خمس ساعات. بعد إجراء الحضانة ، خذ المستحضر ، وقم بإزالة ماصة التعبئة بمحلول التحميل. ضع المستحضر في الحمام واغسله بمحلول رينجر.

احتفظ بالحمام مع المستحضر طوال الليل في الثلاجة عند درجة حرارة ثماني درجات مئوية. تحضير الأنسجة للفحص المجهري. خذ التحضير من الحمام.

قم بتركيب التحضير في غرفة مبطنة بالفضة وقم بتمديد الأنسجة قليلا. اشطف المنديل بمحلول Ringer الطازج. خذ قطب تحفيز الشفط.

ضع قطب الشفط التحفيزي في الغرفة مع طرفه بالقرب من الطرف المقطوع للعصب. اسحب العصب إلى القطب. تم وصف بناء القطب في مقال خازوكوف ، ويوجد رابط للمقال في المواد.

إصلاح غرفة التحضير على مرحلة المجهر. ضع مسبار درجة الحرارة. قم بتوصيل أنابيب التدفق في سلك طاقة لعنصر بلتيير في غرفة التحضير.

ضع أنبوب التدفق في غرفة التحضير. قم بتشغيل مضخة التروية. قم بتشغيل وحدة التحكم في المصطلحات.

اضبط درجة الحرارة على وحدة التحكم لتصل إلى 20 درجة مئوية. قم بتثبيت درع الحماية من الأشعة فوق البنفسجية. قم بإعداد مدة التأخير والفترة على المحفز.

قم بتوصيل سلك من قطب الشفط بالمحفز. قم بتشغيله. تحت هدف التكبير المنخفض ، تحقق من تقلص العضلات عن طريق تشغيل المنبه.

املأ نظام التروية بمحلول Ringer بانخفاض الكالسيوم والمغنيسيوم العالي. اضبط معدل التروية بحوالي ملليلترين في الدقيقة. يستعاض عن هدف التكبير 40 مرة.

قم بتشغيل الطول الموجي للانبعاث متعدد الألوان V.Select وإضاءة الوضع المستمر. افتح الغالق. أقل من هدف التكبير 40 مرة ، في وضع التألق ، تضمن الإضاءة تحميل المحطات.

ابحث عن الجهاز وركز عليه. يتم تمثيل العصب المحمل والمحطات العصبية الحركية المحملة جيدا على الشكل. التقاط الفيديو باستخدام كاميرا CCD العصبية ذات اللون الأحمر القصير.

قم بتشغيل برنامج Turbo-SM. حدد ، قم بتغيير الإعدادات. عدد الإطارات المدخلة هو 500.

أدخل اسم التجربة. التكوين الأساسي هو 1000 إطار في الثانية. 80 × 80.

اختر مشغل خارجي. أدخل وقت ما قبل التشغيل. ناقص عشرة مللي ثانية.

أدخل عدد التكرارات ، 20. في برنامج متعدد الألوان، حدد وضع إضاءة المشغل الخارجي. قم بتشغيل برنامج Clampex.

بروتوكول تحفيز الحمل. البروتوكول متاح للتنزيل من صفحة المختبر الخاصة بنا على موقع جامعة قازان الفيدرالية. قبل التسجيل ، التقط إطارا داكنا في برنامج Turbo-SM.

على المكعب ثلاثي العينات، حدد مستويات تبادل مسار الضوء. 100 بالمائة للكاميرا. قم بتشغيل بروتوكول التحفيز.

حدد منطقة الاهتمام وتحقق من الإشارة. استجابة لتحفيز الأعصاب ، نسجل التغيير في شدة التألق الذي يعكس دخول الكالسيوم إلى النهاية العصبية. تحليل البيانات.

في برنامج Turbo-SM، حدد ملف. ثم حدد متوسط الملفات. حدد الملفات.

أدخل اسم متوسط الملف، وقم بمتوسطه. احفظ متوسط الملف كملف مناسب. حدد ، احفظ كملف مناسب.

أدخل اسم الملف واحفظه. قم بتشغيل الصورة J ، وافتح الأدوات أدناه. التحليل والأدوات ومدير العائد على الاستثمار.

ابحث عن ملف متوسط محفوظ بتنسيق مناسب. اسحبه وأفلته في Image J.Zoom النافذة للحصول على عرض أفضل. حدد منطقة مستطيلة ذات أهمية فوق ما تعتقد أنه خلفية.

أضفه إلى مدير عائد الاستثمار. في مدير ROI ، حدد المزيد. متعدد القياسات. تحميل يعني.

نسخ البيانات وتصديرها إلى Excel. في Excel ، استخدم دالة المتوسط لحساب متوسط قيمة الخلفية للنسبة. بدون إغلاق Excel ، ارجع إلى الصورة J.أغلق النافذة مع حساب الخلفية دون حفظ.

استخدم مدير العائد على الاستثمار ، احذف رسم الخلفية المستطيل. عملية الأداة المفتوحة ، الرياضيات ، الطرح. أدخل متوسط قيمة العتبة المحسوبة من Excel، واطرح الأرض من المكدسات.

حدد منطقة مستطيلة ذات أهمية حول طرف عصبي. أضفه إلى مدير العائد على الاستثمار. في مدير العائد على الاستثمار ، حدد ، المزيد ، متعدد القياس ، التحميل ، المتوسط.

انسخ والصق في نافذة Excel. استخدم الرسم البياني لأداة Excel. حدد منطقة مسطحة قبل بدء الإشارة.

قم بتحميل الرسم البياني بالتفاصيل من القيم الأولى للتألق في الباقي ، إلى بداية الإشارة. ثم حدد عدد النقاط لمتوسط قيم مضان الراحة. متوسط هذه القيم ، ثم أوجد متوسط عدد التألق في الباقي.

اقسم الإشارات على التألق في الباقي. اطرح واحدا واضرب في 100 بالمائة. ارسم الإشارة واحسب سعة الكالسيوم العابر.

تعتمد المعلمات الزمنية لإشارات التألق على سرعة التفاعلات الأمامية أو العكسية لتكوين مركب صبغة الكالسيوم. يمثل وقت صعود إشارة الكالسيوم ديناميكيات مدخلات الكالسيوم. إنه انتشار في الطرف ، وتفاعل الكالسيوم مع الصبغة.

يعتمد تحلل الكالسيوم العابر على تقارب الصبغة ومعدل تخزين الكالسيوم وسحبه. يمكن استخدام تحليل سعة الكالسيوم العابرة لدراسة تأثير المواد الفعالة المختلفة على دخول الكالسيوم التي تشارك في إطلاق الناقل العصبي. تقنية التحميل هذه مناسبة تماما لتصوير التغيرات في الكالسيوم الخلوي.

مع مؤشرات الفلورسنت وتحفيز العصب الفردي والنشاط المشبكي الإيقاعي. يمكن استخدام تحليل سعة الكالسيوم العابرة لدراسة تأثير المواد المختلفة على دخول الكالسيوم الذي يشارك في إطلاق الناقل العصبي. هناك بعض النقاط المهمة التي نريد الانتباه إليها.

تتضمن إجراءات الحضانة خطوتين. حضانة في درجة حرارة الغرفة وفي الثلاجة. من المهم التحكم في وقت الحضانة بالصبغة في درجة حرارة الغرفة.

اعتمادا على طول جذع العصب والصبغة ودرجة الحرارة في الغرفة ، قد يختلف وقت الحضانة. إذا قمت بتعريض أطراف ما قبل العملية والأجزاء القريبة ، بالقرب من جذع العصب ، يمكن أن تكون محملة بشكل زائد. بسبب الحضانة الطويلة في الثلاجة ، يتم توزيع الصبغة بالتساوي على طول النهايات العصبية.

من الضروري وضع العصب في محلول تحميل الصبغة ، في غضون عدة دقائق بعد القطع ، للسماح للصبغة بالدخول إلى العصب ، لأن الفترات الزمنية الأطول أنتجت تحميلا غير فعال ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب تلقي العصب المغلق. لتقليل تقسيم الصبغة ، من الممكن استخدام الشكل الممتد للصبغة. من المهم جدا منع الإضاءة الفلورية الطويلة للأنسجة لأنها تؤثر على بقائها على قيد الحياة.

نستخدم بصريات Nomarski في قناة الضوء المرئي للبحث عن المحطات. أثناء التسجيل ، نحد من العرض المضيء ، بواسطة الحجاب الحاجز. يمكن تقليل المدة الطويلة لعملية التحميل باستخدام ختم مصراع العصب.

في هذه الحالة ، يمكن استخدام المجازة الزجاجية الدقيقة.