الإنتاج والإدارة العلاجية الجذعية الوسيطة / اللحمية الخليوي (MSC) الأجسام الشبه الكروية معبى في الثقافات 3-D تحت ظروف كره خالية

الهدف العام من هذه التجارب هو إنتاج وحقن تجمعات كروية علاجية، أو كرويات، من الخلايا الجذعية/السدوية الميزنشيمية، أو MSCs، بكفاءة عالية، بعد تحضيرها في ظروف خالية من المكونات الغريبة (xeno-free) لاستخدامها في التطبيقات التجريبية والسريرية. يمكن لهذه الطرق أن تساعد في التغلب على العوائق الرئيسية في مجال العلاجات القائمة على MSCs، مثل ضعف استبقاء الخلايا وبقائها على قيد الحياة وقدرتها الوظيفية، وهو ما يُلاحظ غالباً بعد زراعة الخلايا المشتتة وفي الظروف الضارة المرتبطة عادةً بإصابات الأنسجة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الإجراءات في إمكانية تحضير كرويات الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC spheroids) وتهيئتها وحقنها في غياب المنتجات الحيوانية المسببة للاستجابة المناعية، مثل مصل الجنين البقري (FBS)، وهو ما يحد حالياً من بعض التطبيقات السريرية لهذه الخلايا ويمكن أن يؤدي أيضاً إلى تضليل تفسير بعض البيانات قبل السريرية. وبالرغم من أن هذه الآلية قد تكون مفيدة جداً في توسط الفعالية القائمة على الخلايا الجذعية الميزنكيمية، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لفهم إصلاح الأنسجة بوساطة هذه الخلايا وكيفية تأثير تركيبات الأوساط الأخرى على الميزة الجينية العلاجية. سيقوم بشرح هذه الإجراءات كل من جوش بيفر وبريت كلو، وهما فنيان من مختبري.

بعد استزراع وتحضين الخلايا الجذعية الميزنكيمية، وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم trypsin وEDTA لحصد الخلايا؛ وبعد طرد الخلايا المحصودة مركزياً عند 450 ×g، اجمع كافة الخلايا في أنبوب مخروطي واحد مع الوسط المناسب. قم بطرد الخلايا مركزياً ثم أعد تعليق الراسب في حجم صغير من الوسط. بعد ذلك، وعقب عد الخلايا، ولتوليد كرويات تتكون من 25,000 خلية تقريباً، خفف الخلايا الجذعية الميزنكيمية المحصودة في أحد الأوساط التالية بتركيز 714 خلية لكل µL.

بعد ذلك، يتم وضع قطرات بحجم 35 µL من الخلايا على الجانب السفلي لغطاء طبق زراعة مقلوب بقطر 150 mm. يتم نقل 20 mL من PBS بدرجة حرارة الغرفة إلى قاعدة الطبق، وبحركة واحدة مستمرة وثابتة، يُقلب الغطاء الذي يحتوي على القطرات بحيث تكون رؤوس القطرات متجهة لأسفل. ثم يُوضع الغطاء بعناية على قاعدة طبق الزراعة.

انقل الطبق إلى الحاضنة لمدة ثلاثة أيام دون تحريكه للسماح بتجمع الكريات بشكل مناسب. بعد انتهاء فترة التحضين، ابدأ في حصاد الكريات عن طريق إزالة الغطاء بعناية وقلبه بحيث تصبح القطرات مواجهة للأعلى مرة أخرى. ثم قم بإمالة الغطاء بزاوية تتراوح ما بين 10 إلى 20 درجة تقريبًا واستخدم رافع الخلايا لدفع القطرات التي تحتوي على الكريات نحو حافة الطبق.

باستخدام ماصة سعة 1 مل، انقل الوسط المحيط بالكرات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل، واستخدم PBS بدرجة حرارة الغرفة وبنفس رأس الماصة لغسل الطبق لضمان أقصى قدر من استعادة الكريات. وبالنسبة لمقايسات PCR في الوقت الحقيقي، قم بطرد مركزي لمعلق الكريات عند 450 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم اسحب الطافي.

اغسل الكريات باستخدام محلول PBS، وكرر خطوتي الطرد المركزي والشفط. ولغرض الحقن في الحيوانات، اترك الكريات تترسب في قاع الأنبوب دون استخدام جهاز الطرد المركزي. ولجمع الوسط المشروط، أو CM، لإجراء فحوصات القدرة المناعية والمضادة للسرطان، قم بحصاد الكريات والوسط المشروط (CM) في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter باستخدام رافعة الخلايا والماصة كما تم توضيحه للتو.

ومع ذلك، لا تغسل الأغطية بمحلول PBS. بعد إجراء عملية الطرد المركزي عند 450 ×g لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، انقل السائل الطافي إلى أنابيب سعة 1.5 مل. قم بطرد السائل الطافي مركزياً عند 10,000 ×g وفي درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق.

بعد ذلك، استخدم ماصة لجمع الوسط المشروط (CM) المصفى بعناية في أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر للتخزين عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. وبعد تحضير الكرويات كما تم توضيحه في هذا الفيديو والانتظار لمدة ثلاث إلى أربع دقائق حتى تترسب في قاع الأنبوب، قم بشفط السائل الطافي واغسل الكرويات بإضافة HBSS مضاف إليه 0.2 إلى 0.5% HSA للحفاظ على ظروف خالية من المواد الغريبة (xeno-free). بعد ذلك، قم بشفط السائل الطافي.

قم بتغطية الكريات الخلوية بـ 100 إلى 200 µL من HBSS/HSA المعقم وضع الأنابيب على الثلج. بعد تخدير الفأر وفقاً لبروتوكول النص، ضع الحيوان داخل كابينة BSL-2، بحيث يكون الجانب الظهري للأسفل واستخدم ethanol بتركيز 70% لتطهير الجزء السفلي من بطن الفأر. قم بإزالة غطاء قسطرة وريدية مقاس 20-gauge، وأثناء تثبيت جلد الفأر بإحدى اليدين، حدد منتصف خط وهمي يربط بين مفصل الركبة المثني والمنطقة التناسلية، ومع توجيه طرف إبرة مجموعة القسطرة نحو الخط المتوسط، استخدم اليد الأخرى لإجراء حقن داخل الصفاق.

قم بإزالة إبرة المسبار المعدنية برفق من مجموعة مسبار القسطرة. افحص المسبار للتأكد من عدم وجود دم أو بول أو براز ثم تخلص منها. تحقق من وضع القسطرة البلاستيكية بشكل صحيح عن طريق إدخال رأس ماصة سعة 100 إلى 200 ميكرولتر يحتوي على 100 µL من محلول HBSS/HSA المعقم في محول محقنة القسطرة مع تكوين سدادة محكمة.

بعد ذلك، قم بحقن السائل ببطء داخل التجويف البريتوني. باستخدام طرف ماصة سعة 100 إلى 200 ميكرولتر، اجمع كرويات MSA ومحلول HBSS/HSA وانقل الحجم بالكامل إلى التجويف البريتوني عبر القسطرة كما تم توضيحه للتو. بعد ذلك، وباستخدام 100 ميكرولتر من HBSS/HSA، اغسل الأنبوب الذي يحتوي على الكرويات وانقل الحجم الكامل من الكرويات إلى التجويف البريتوني.

ضع قطعة شاش مشبعة بمطهر فوق القسطرة، ثم اسحب القسطرة ببطء من التجويف البريتوني وتخلص منها. افحص القسطرة للتأكد من عدم وجود أي كرويات متبقية. بعد ذلك، قم بتدليك التجويف البريتوني بلطف باستخدام الأصابع لضمان التوزيع المتساوي للكرويات.

مباشرة بعد حقن الكريات في الفئران، يتم تقييم مستوى تنشيط الكريات المُعدة للحقن عن طريق نقل من 40 إلى 120 كرة إلى القسطرة داخل صفيحة ذات 12 أو 6 آبار تحتوي على 1 إلى 2 ملليلتر من Alpha MEM المكمل بـ 2%FBS و 1X penicillin streptomycin. وبعد مرور ست ساعات، يتم نقل الوسط من الآبار إلى أنابيب سعة 1.5 أو 15 ملليلتر، ثم تُطرد الأنابيب مركزياً عند 450 ×g وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وأخيراً، يتم نقل الوسط المُكيف (CM) الرائق إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر، واستخدام طقم ELISA تجاري وفقاً للبروتوكول المكتوب لتقدير تركيز PGE-2.

كما هو موضح هنا، عندما يتم تعليق 25,000 تقريبًا من الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) في قطرات بحجم 35 µL من وسط استزراع الخلايا الميزنكيمية (CCM)، تتجمع الخلايا أولاً في تكتلات صغيرة، ولكنها تلتحم في النهاية لتكوين كرة مدمجة واحدة عند 72 ساعة في قمة القطرة. يوضح هذا الشكل أن تكوين كرات مدمجة مفردة ووسط XFM-1 يتطلب تدعيمًا بـ 13 mg/mL من ألبومين المصل البشري (HSA)، وهو تركيز يعكس محتوى البروتين الكلي المقدر في CCM. وأثناء تجميع الكرات، يتغير النمط الظاهري للخلايا الجذعية الميزنكيمية بشكل جذري، وعندما تكون في وسط خالٍ من المكونات الحيوانية ومحدد كيميائيًا بشكل مناسب، يزداد تعبير العديد من العوامل المضادة للالتهابات، بما في ذلك PGE2 و TSG6.

ومع ذلك، فإن إنتاج TSG6 و PGE2 لا يزداد بشكل ملحوظ في الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) التي تمت زراعتها على هيئة كرات في XFM-2 أو XFM-1 بدون HSA. وأخيرًا، ومحاكاةً للتأثيرات المخبرية، فإن كرات XFM-1 HSA التي حُقنت في التجويف البريتوني للفئران، مباشرة بعد تحفيز الالتهاب الجهازِي عن طريق الإعطاء الوريدي لـ LPS، أدت إلى تعزيز مستويات PGE2 و IL-10 في البريتون مع خفض مستوى TNF alpha المسبب للالتهاب. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن تحضير كل طبق من القطرات المعلقة في غضون دقيقة إلى دقيقتين.

ويمكن إتمام عملية الحقن داخل الصفاق للكرات الخلوية السليمة في غضون 5 إلى 10 دقائق لكل حيوان عند تنفيذها بشكل صحيح. وعند إنتاج كرات MSC باستخدام تقنية القطرة المعلقة، من المهم تذكر أن تركيبات الأوساط الخالية من المكونات الحيوانية المختلفة ليست متساوية فيما يتعلق بتكوين الكرات وتعزيز تعبير الجينات العلاجية. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل المجهر البؤري لفهم تنظيم خلايا MSC في الكرات الخلوية، وأيضاً التعرف على مسارات التأشير الإضافية التي قد يتم تنشيطها في خلايا MSC في أجزاء مختلفة من الكرة الخلوية.

بعد هذا التطوير، أتاحت هذه الطريقة لعلماء الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) دراسة ظروف زراعة ثلاثية الأبعاد أخرى ومدى تأثيرها على تهيئة هذه الخلايا والتعبير عن الجينات العلاجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تهيئة الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) ككرات خلوية باستخدام تقنية القطرة المعلقة، وكيفية تقييم فعاليتها العلاجية في المختبر (in vitro)، وكيفية نقل الكرات الخلوية السليمة بفعالية إلى الفئران لاختبار الفعالية في الجسم الحي (in vivo). ولا تنسَ أن العمل مع الخلايا الجذعية البشرية البالغة يتطلب معدات وتدريباً خاصاً، وقد يكون خطيراً إذا لم يتم التعامل مع الخلايا بشكل صحيح.

يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات عند التعامل مع الخلايا الجذعية البشرية البالغة.