الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

الهدف العام من هذا البروتوكول هو قياس الفسفرة الذاتية لكينازات الهستيدين البكتيرية المنقاة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال إشارات المكونين، مثل تأثير المحفزات المتوافقة في التفاعلات بين البروتينات على الفسفرة الذاتية لكينازات الهستيدين.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في كونها طريقة ذات إنتاجية عالية يمكن استخدامها للكشف بدقة عن بيكومولات من الفوسفوهيستيدين المتكون، والحصول على المعاملات الحركية لكينازات الهيستيدين. وبصفتي زميلاً في أبحاث ما بعد الدكتوراه، فإنني أستخدم الترشيح على أغشية النيتروسليلوز لقياس كمية اللجائن المشعة المرتبطة بالبروتين. بناءً على ذلك، كان من المنطقي تطوير تقنية مماثلة لقياس فسفرة الهيستيدين في كينازات الهيستيدين البكتيرية.

ابدأ هذا الإجراء بتحضير الكواشف والمواد كما هو موضح في البروتوكول النصي. ولتجهيز جهاز مخطط النقاط (dot-plot) المكون من 96 بئراً، قص قطعة من غشاء النيتروسيلولوز بمقاس 8 سنتيمتر في 12 سنتيمتر. ثم ضع غشاء النيتروسيلولوز في جهاز مخطط النقاط.

تأكد من ملاءمة الغشاء بحيث يكون الجهاز محكماً وجميع الآبار مغطاة بالكامل بالغشاء. ولجمع الراشح، قم بتوصيل الجهاز بقارورة جانبية ثانوية. ومن ساق الصمام، قم بتوصيل أنابيب مناسبة تتيح استخدام الجهاز بشكل مريح دونما يؤدي ذلك إلى إمالة القارورة الثانوية.

بعد ذلك، قم بتوصيل دورق الذراع الجانبية الثانوي بمصدر تفريغ هوائي (aspirator). اختبر ما إذا كان الجهاز محكم الإغلاق تمامًا عن طريق تطبيق تفريغ هوائي على الجهاز. إذا تم تجميع الجهاز بشكل صحيح، فسيكون هناك تفريغ هوائي قوي في جميع الآبار.

يمكن لف tất جميع وصلات الأنابيب بـ Parafilm أو غلاف Saran لضمان إحكام الغلق. قبل البدء، قم بتحضير جميع مكونات التفاعل الأربعة كمحاليل مخزنة بتركيز 4X، كما هو موضح في البروتوكول النصي. اخلط أحجاماً متساوية من منظم التفاعل، وhistidine kinase، والماء المقطر مرتين.

اترك مكونات التفاعل هذه لتتوازن في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة. لبدء التفاعل، أضف حجماً واحداً من محلول gamma-32 P ATP وامزجه عن طريق السحب والطرد باستخدام الماصة. تتبع الوقت المنقضي للتفاعل باستخدام مؤقت، واترك التفاعل يستمر للمدة المطلوبة.

قم بإيقاف التفاعل. أضف جزءاً مقنناً من التفاعل إلى حمض الفوسفوريك بتركيز 325 millimolar. ضع التفاعلات الموقوفة على الثلج فوراً حتى يتم إنهاء جميع التفاعلات.

ضع جهاز المخطط النقطي (dot-plot) المكون من 96 بئراً والمجمع مسبقاً داخل حاوية ثانوية. يجب أن تكون هذه الحاوية كبيرة بما يكفي لتسهيل عملية تفكيك الجهاز بداخلها، حيث سيكون الجهاز والغشاء مشعين بعد الاستخدام. قم بتطبيق تفريغ هوائي (vacuum) على جهاز المخطط النقطي المكون من 96 بئراً.

بمجرد وضع الجهاز تحت تفريغ هوائي، قم بنقل تفاعل الإخماد بعناية باستخدام الماصة مباشرة إلى غشاء النيتروسليلوز في كل بئر. كرر هذه العملية حتى يتم تحميل جميع التفاعلات على الغشاء. نظرًا لأن سعة الارتباط للنيتروسليلوز أكبر من كمية كيناز الهيستيدين المرصودة، يمكن افتراض أن جميع الكيناز تقريبًا يرتبط بالغشاء عند تحميله بشكل صحيح.

اعتماداً على الجهاز المستخدم، توخَّ الحذر لتجنب ثقب غشاء النيتروسليلوز. تأكد من أن جميع مواد التفاعل قد لامست النيتروسليلوز، حيث من السهل أن تلتصق بعض مواد التفاعل بجدران البئر.

اغسل الآبار بـ 100 µL من حمض الفوسفوريك بتركيز 25 mM المبرد في الثلج. سيتيح ذلك لأي حجم من التفاعل قد يكون محتبساً في البئر الوصول إلى الغشاء، مما يضمن التحميل الكامل لجميع التفاعلات. اترك الحجم بالكامل يتدفق عبر الغشاء.

قم بتفكيك الجهاز بعناية قبل إيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية (الخلخلة). يرجى العلم أن كلاً من الجهاز وغشاء النيتروسليلوز يكونان مشعين في هذا الوقت. لا تقم بإخراج أي من مكونات الجهاز من الحاوية الثانوية.

باستخدام الملقط، انقل غشاء النيتروسليلوز بعناية من الجهاز إلى وعاء يحتوي على 200 ملليلتر تقريباً من حمض الفوسفوريك بتركيز 25 ملي مولار والمبرد بالثلج. ضع غطاءً على هذا الوعاء، حيث إن عملية الغسل ستتضمن مواد مشعة. في هذه المرحلة، يمكن إيقاف تشغيل جهاز التفريغ.

ضع الوعاء الذي يحتوي على غشاء الغسيل على جهاز هزاز. اترك الغشاء يهتز بلطف لمدة 20 دقيقة. بعد مرور 20 دقيقة، اسكب محلول الغسيل المستخدم بعناية في دلو كبير لاستخدامه في تخزين النفايات المؤقت.

أضف 200 milliliters من حمض الفوسفوريك بتركيز 25 millimolar المبرد بالثلج إلى الغشاء. اغسل الغشاء بهذه الطريقة ثلاث مرات على الأقل لإزالة إشارة gamma-32 P ATP الخلفية من الغشاء. بعد الغسلة الثالثة، اختبر محلول الغسيل المستخدم للكشف عن الإشعاع باستخدام عداد جيجر.

استمر في غسل الغشاء حتى يختفي أي أثر للإشارة في محلول الغسل. بعد غسل الغشاء بشكل كافٍ، اترك الغشاء ليجف في الهواء لفترة وجيزة، وهو ما يستغرق عادةً خمس دقائق أو أقل. بعد تعريض النتروسليلوز للفوسفور الأخضر، كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بالتحضير لعمليتي الصبغ وإزالة الصبغ بصبغة Ponceau S.

اغمر غشاء النيتروسليلوز لفترة وجيزة في محلول صبغة Ponceau S لمدة تتراوح بين دقيقة ودقيقتين. بلل الغشاء بالكامل بالصبغة قبل البدء في عملية إزالة اللون. بعد ذلك، قم بتفريغ فائض صبغة Ponceau S من الغشاء.

اشطف الغشاء بالماء المقطر مرتين حتى تتبقى فقط البقع المصبوغة بـ histidine kinase. لاحظ أن هذا الإجراء لن ينجح إلا إذا كانت جميع البقع تحتوي على كميات قابلة للكشف من البروتين. باستخدام مقص، قم بقص كل بقعة على غشاء النيتروسليلوز.

ليس من الضروري القص بدقة تامة على حافة البقعة المصبوغة. فإذا تم غسل الغشاء بشكل كافٍ، فإن الخلفية الناتجة عن تفاوت حجم البقع المقصوصة تكون ضئيلة. المهم فقط هو قص البقعة بأكملها لكل تفاعل.

باستخدام الملقط، انقل كل بقعة بعناية إلى قوارير الوميض. لا يلزم استخدام كوكتيل وميض، حيث يمكن الكشف عن الفسفور 32 بسهولة عن طريق إشعاع شيرينكوف. بعد ذلك، ضع عدة تخفيفات من محلول gamma-32 P ATP على مربعات من النيتروسليلوز بمقاس واحد سنتيمتر في واحد سنتيمتر.

باستخدام الملاقط، انقل كل مربع بعناية إلى أنابيب وميضية خالية من كوكتيل الوميض. ستُستخدم هذه العينات لإنشاء منحنى قياسي لتحديد عدد النبضات في الدقيقة لكل بيكومول من محلول ATP. يظهر هنا صبغ غشاء النيتروسليلوز بصبغة بونسو.

يظهر الصبغ بشكل متجانس في جميع العينات، مما يشير إلى أن جميع العينات قد تم تحميلها بكميات متساوية. وتوضح نتائج التصوير الفلوري لغشاء النيتروسليلوز المستوى النسبي للفوسفوهيستيدين المسمى إشعاعياً في كل بقعة. ويمثل الصف الرابع والثامن ضوابط سلبية تثبت غسل فائض ATP من غشاء النيتروسليلوز.

تظهر هنا النتائج الممثلة لقياس كمية الفسفرة الذاتية لإنزيم هيستيدين كيناز. وقد تم استخلاص هذه البيانات من خلال العد الوميضي لكل بقعة تم قصها من الغشاء. كما أن منحنى المعايرة لعدد الومضات في الدقيقة لكل بيكومول من ATP الموضح هنا قد تم إنتاجه أيضاً عن طريق العد الوميضي، ويُستخدم لحساب البيكومولات من الفسفو-هيستيدين الموجودة في كل عينة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إضافة طرق أخرى إلى التجربة، مثل إدخال محفزات متجانسة أو بروتينات يُفترض أنها تعدل نشاط الكيناز، للإجابة على أسئلة إضافية مثل تأثير هذه الإضافات على نشاط الكيناز. ولا تنسَ أن العمل بالمواد المشعة قد يكون خطيراً للغاية؛ لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء، مثل التدريب المناسب على السلامة الإشعاعية واستخدام معدات الوقاية الشخصية والدروع الواقية.