إعادة بناء واسعة النطاق والمستقل، تجميع غير متحيز واستنادا المورفولوجية المقاييس لتصنيف الخلايا العصبية في الانتقائي السكان

يصف هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من السكان العصبية انتقائية، وصفت بعد الإصابة الوراء مع فيروس داء الكلب المعدلة ويعبرون عن علامات الفلورسنت، ومستقلة، مجموعة مشاركات التحليلات التي تمكن توصيف شامل من المقاييس المورفولوجية بين الفئات الفرعية العصبية متميزة.

تتمثل أهداف هذا البروتوكول في وصف خطوات إعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية المسماة بالفيروسات وإجراء تحليلات عنقودية مستقلة وغير متحيزة على مجموعات الخلايا العصبية المصنفة لتمكين التوصيف الشامل للمقاييس المورفولوجية على طول الفئات الفرعية العصبية المتميزة. نحدد نهجا جديدا لجمع البيانات التشريحية العصبية وتحليلها لتسهيل أخذ عينات أكثر شمولا وتصنيفا غير متحيز لأنواع الخلايا العصبية الفريدة شكليا داخل مجموعة الخلايا العصبية الانتقائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح تحليلا واسع النطاق لمورفولوجيا الخلايا العصبية وتستخدم طرقا غير متحيزة لتصنيف الفئات الفرعية العصبية المتميزة.

تتمثل الجوانب الأكثر تحديا في عمليات إعادة البناء المورفولوجية في اختيار الخلايا العصبية المعزولة جيدا لإعادة البناء ، وتعيين عمق z المناسب ، ومحاذاة العرش لمواصلة عمليات إعادة البناء عبر أقسام الأنسجة المجاورة. ابدأ إعادة البناء عن طريق اختيار شريحة تحمل قسما ملطخا من أنسجة المخ بحجم 50 ميكرون من رئيسيات محقونة بشكل مجسم بفيروس داء المعدل الذي يعبر عن EGFP. ضع الشريحة في حامل شريحة المجهر وركز على قسم واحد من الاهتمام باستخدام هدف تكبير منخفض.

تأكد من أن صورة الكاميرا مرئية في الصورة الحية عن طريق وضع غالق الكاميرا بشكل صحيح. اختر خلية عصبية معزولة بشكل معقول داخل بنية الدماغ ذات الأهمية لتمكين إعادة بناء لا لبس فيها للأشجار المتغصنة. قم بالتبديل إلى التكبير بمقدار 10x واجعل المنطقة في بؤرة التركيز.

اختر الخلايا العصبية بشكل تفضيلي إذا كان جسم الخلية بالكامل داخل قسم واحد لتقدير مساحتها واستدارتها بدقة. بمجرد اختيار خلية عصبية ملطخة جيدا ومعزولة جيدا ، انقر فوق زر القسم الجديد في البرنامج لإضافة القسم الرئيسي الذي يحتوي على جسم الخلية إلى مدير القسم. أدخل عدد الأقسام المراد تضمينها في إعادة البناء.

نوصي بإدخال قسمين إلى ثلاثة أقسام للبدء. قم بتعيين سمك قسم 50 ميكرون. اختر الهدف الاثنين x ثم انقر فوق زر الكنتور في شريط الأدوات العلوي واختر نوع الكفاف من القائمة المنسدلة.

تتبع محيط البنية المستهدفة باستخدام الماوس للنقر على النقاط على طول المحيط. عند الانتهاء من تتبع المحيط، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس وحدد إغلاق المحيط من القائمة لإغلاق المحيط. بعد ذلك ، مع استمرار العرض عند اثنين x ، انقر فوق رمز العلامة المطلوب على شريط الأدوات الأيسر.

ثم انقر فوق منتصف الهيكل المستهدف لوضع العلامة. بمجرد اكتمال الخطوط ، حدد هدف 40x أو 60x لتتبع الخطوط العريضة لجسم الخلية. ثم حدد زر تتبع الخلايا العصبية في شريط الأدوات العلوي وحدد بنية الخلايا العصبية لتتبع ، في هذه الحالة ، جسم الخلية ، من القائمة المنسدلة.

تتبع جسم الخلية بالنقر فوق النقاط حول أكبر مدى لجسم الخلية ، وضبط عمق z حسب الحاجة لتركيز جسم الخلية. والنقر بزر الماوس الأيمن على الماوس لإنهاء محيط جسم الخلية. بعد ذلك ، ضع علامة نمط مختلفة في وسط محيط جسم الخلية ، مع التأكد من أن العلامة في المركز تقريبا في عمق z.

من الأهمية بمكان إنشاء عمق z الصحيح في القسم الرئيسي وكذلك في الأقسام المجاورة ، قبل البدء في كل تتبع بحيث تكون قيم المحور Z دقيقة. لبدء تتبع العرش المتغصنة ، حدد التغصنات من القائمة المنسدلة العلوية.

ثم تتبع كل تغصنة بدءا من جسم الخلية. عندما يتفرع التغصن، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس وحدد عقدة متشعبة أو عقدة ثلاثية التشعب لوضع عقدة عند نقطة الفرع هذه. تأكد من ضبط عمق z طوال التتبع لالتقاط زاوية واتجاه التغصنات بدقة.

في نهاية التغصنات في هذا القسم ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس وحدد النهاية من القائمة المنسدلة. عندما يتم تتبع جميع العرش المتغصنة في القسم الرئيسي ، حدد تلك النهايات المتغصنة التي من المحتمل أن تستمر في القسم المجاور. وقم بالتركيز عليها عند عمق z المناسب في صورة المجهر عند 20x.

قم بتضمين المعالم الرئيسية القريبة مثل الأوعية الدموية أو أنماط التغصنات أو الحزم التي يمكن التعرف عليها بسهولة في صورة المجهر. بعد ذلك ، التقط صورة للصورة الحية باستخدام كاميرا رقمية محمولة باليد على شاشة الكمبيوتر. ثم قم بتبديل هدف المجهر إلى اثنين x وانتقل إلى القسم المجاور على الشريحة.

ثم قم بمحاذاة ملامح القسم الذي تم تتبعه مسبقا في عرض البرنامج مع حدود LGN و TRN في القسم الجديد. ارجع إلى 20x وقم بالمحاذاة باستخدام المعالم. بعد ذلك ، بمساعدة صورة نهايات التغصنات من القسم الذي تم تتبعه مسبقا ، انقل التتبع لمحاذاة التشعبات باستخدام أداة السهم أولا لتحديد إعادة البناء.

ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد نقل من القائمة المنسدلة وحرك التتبع وفقا لذلك. لتدوير التتبع ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد تدوير من القائمة المنسدلة وقم بتدوير التتبع وفقا لذلك. بدلا من ذلك ، حدد أداة المطابقة من القائمة المنسدلة للأدوات العلوية وحدد عدد النقاط المراد مطابقتها.

ثم انقر فوق النهاية في إعادة الإعمار ونقطة الاستمرار المقابلة في الصورة الحية لمطابقة النهايات الشجيرية مع البدايات. بمجرد اصطفاف التتبع من القسم السابق مع التشعبات في القسم الجديد ، أضف قسما جديدا إلى مدير القسم كما كان من قبل. بدلا من ذلك ، ما عليك سوى تحديد القسم المجاور الذي تم إنشاؤه مسبقا وضبط عمق z بنفس الطريقة.

تأكد من تحديد القسم الجديد المقابل في مدير القسم بالنقر فوق القسم الحالي. بعد ذلك ، بعد زيادة التكبير إلى 40x أو 60x ، حدد التغصنات باستخدام السهم. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس في نهاية التغصنات من القسم السابق وحدد إضافة إلى النهاية من القائمة المنسدلة.

ستسألك رسالة مطالبة عما إذا كانت المتابعة موجودة في قسم جديد. انقر فوق نعم. ثم تتبع استمرار التغصنات باستخدام الماوس كأداة رسم.

التقط صورا للنهايات استعدادا للمحاذاة مع القسم التالي. ثم أضف استمرارية إلى التتبع الشجيري حتى يتم تتبع ثلاثة أقسام على الأقل للخلايا العصبية أو حتى يتعذر متابعة التشعبات أو العثور عليها. باستخدام برنامج استخراج مرتبط بنظام إعادة بناء الخلايا العصبية ، افتح ملف إعادة بناء مكتمل.

من القائمة المنسدلة تحرير، حدد تحديد جميع الكائنات. حدد تحليل بنية الفرع من شريط أدوات التحليل العلوي ثم انقر فوق كل علامة تبويب وحدد خيارات التحليل المطلوبة في كل علامة تبويب. استخرج جميع البيانات المطلوبة بالنقر فوق الزر "موافق" في نافذة التحليل واحفظها بتنسيق جدول بيانات عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على نوافذ الإخراج وتحديد تصدير إلى Excel لمزيد من التحليل.

تظهر هذه الصورة قسما إكليليا واحدا من خلال LGN الظهري لحيوان واحد. يستخدم تلطيخ السيتوكروم أوكسيديز لتصور طبقات LGN. ويشير تلطيخ GFP إلى موقع حقن الفيروس.

يشير السهم إلى مناطق من الخلايا العصبية الشبكية الكثيفة ذات العلامات الرجعية والمهادية. اتجاه القسم وفقا للبوصلة الجانبية الإنسية البطنية الظهرية الموضحة. شريط المقياس موضح في الزاوية اليسرى السفلية.

توضح هذه الصورة الخطوط العريضة المحيطية ل LGN باللون الأحمر و TRN باللون المارون لجميع الأقسام التي تحتوي على حقن الفيروس كما هو موضح في الخطوط السوداء. تشير النجوم الصفراء إلى مراكز مواقع الحقن. تظهر هذه الصورة العرض ثلاثي الأبعاد للخطوط وموقع الحقن.

هذه خريطة لمواقع الخلايا العصبية TRN المعاد بناؤها والمرمزة بالألوان وفقا لتعيين الكتلة داخل محيط TRN إجمالي واحد موضح باللغة المارونية. يمثل شريط المقياس 500 ميكرون. تظهر هذه الصورة ملامح إجمالية ل TRN باللون الأسود و LGN باللون الرمادي مع خمس خلايا عصبية TRN معاد بناؤها ملونة دافئة إلى باردة وفقا لموضعها الجانبي الإنسي داخل TRN.

يمثل شريط المقياس 500 ميكرون. تظهر هذه الصور تفاصيل نفس الخلايا العصبية الخمسة TRN مع أشرطة مقياس متطابقة بالألوان تمثل 100 ميكرون. توضح شجرة التغصنات الهرمية هذه مسافات الارتباط بين 160 خلية عصبية TRN معاد بناؤها بناء بناء على 10 مقاييس مورفولوجية مستقلة وتظهر النتائج الإجمالية لتحليل العنقود.

يتم توضيح ثلاث مجموعات متميزة من الخلايا العصبية TRN باللون الأزرق والأخضر والأحمر. بمجرد إتقان تقنيات إعادة بناء الخلايا العصبية هذه ، يمكن إعادة بناء خلية عصبية واحدة بالكامل في غضون ساعة إلى ساعتين. من المهم مراقبة وضبط عمق z باستمرار أثناء إعادة بناء الخلايا العصبية.

يعد البروتوكول الموضح هنا تحسينا على طرق التحليل التشريحي العصبي التقليدية والأكثر تحيزا ويمكن الباحثين من استكشاف فئات فرعية جديدة من الخلايا العصبية بناء على البيانات المورفولوجية واسعة النطاق. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة بناء الخلايا العصبية من خلال أقسام الأنسجة المجاورة واستخراج البيانات المورفولوجية لمزيد من التحليل.