إعادة بناء واسعة النطاق والمستقل، تجميع غير متحيز واستنادا المورفولوجية المقاييس لتصنيف الخلايا العصبية في الانتقائي السكان

تتمثل أهداف هذا البروتوكول في وصف الخطوات اللازمة لإعادة بناء مورفولوجيا العصبونات الموصومة بالفيروسات، وإجراء تحليلات عنقودية مستقلة وغير متحيزة لمجموعات من العصبونات الموصومة، وذلك لتمكين التوصيف الشامل للمقاييس المورفولوجية عبر الفئات الفرعية العصبونية المتميزة. ونستعرض هنا نهجاً جديداً لجمع البيانات التشريحية العصبية وتحليلها لتسهيل عملية أخذ عينات أكثر شمولاً وتصنيف غير متحيز للأنواع العصبونية الفريدة مورفولوجياً ضمن مجموعة عصبونية انتقائية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح تحليلاً واسع النطاق لمورفولوجيا العصبونات، وتستخدم طرقاً غير متحيزة لتصنيف الفئات الفرعية العصبونية المتميزة.

تتمثل الجوانب الأكثر تحدياً في عمليات إعادة البناء المورفولوجي في اختيار عصبونات معزولة جيداً لإعادة بنائها، وتحديد العمق المحوري (z-depth) المناسب، ومحاذاة التفرعات العصبية لمواصلة عمليات إعادة البناء عبر مقاطع نسيجية متجاورة. ابدأ عملية إعادة البناء باختيار شريحة تحتوي على مقطع نسيجي من دماغ رئيسيات بسمك 50 micron مصبوغ، ومحقون مجسماً (stereotaxically) بفيروس داء الكلب المعدل الذي يعبر عن EGFP. ضع الشريحة في حامل شرائح المجهر وركز على مقطع واحد من المقطع المختار باستخدام عدسة شيئية ذات تكبير منخفض.

تأكد من ظهور صورة الكاميرا في البث المباشر عن طريق وضع غالق الكاميرا بشكل صحيح. اختر عصبونًا مُعلمًا ومعزولًا بشكل مناسب ضمن بنية الدماغ المستهدفة لتمكين إعادة بناء واضحة وغير غامضة للتفرعات الشجيرية. انتقل إلى التكبير 10x واضبط تركيز المنطقة.

يُفضل اختيار العصبونات التي يقع جسم الخلية فيها بالكامل ضمن مقطع واحد لتقدير مساحتها ومدى استدارتها بدقة. وبمجرد اختيار عصبون مصبوغ جيداً ومعزول بشكل واضح، انقر فوق زر المقطع الجديد (new section) في البرنامج لإضافة المقطع الأساسي الذي يحتوي على جسم الخلية إلى مدير المقاطع (section manager). ثم أدخل عدد المقاطع المراد تضمينها في عملية إعادة البناء.

يُنصح بإدراج مقطعين إلى ثلاثة مقاطع في البداية. حدد سمك المقطع بـ 50 microns. اختر العدسة الشيئية 2x ثم انقر فوق زر contour في شريط الأدوات العلوي واختر نوع الـ contour من القائمة المنسدلة.

قم بتتبع محيط البنية المستهدفة باستخدام الفأرة من خلال النقر على نقاط على طول المحيط. عند الانتهاء من تتبع المحيط، انقر بزر الفأرة الأيمن واختر close contour من القائمة لإغلاق المحيط. بعد ذلك، ومع بقاء العرض عند تكبير 2x، انقر على رمز العلامة المطلوب في شريط الأدوات الموجود على اليسار.

بعد ذلك، انقر فوق مركز البنية المستهدفة لوضع العلامة. وبمجرد اكتمال الخطوط الخارجية، اختر العدسة الشيئية 40x أو 60x لتتبع المخطط الخارجي لجسم الخلية. ثم حدد زر تتبع العصبونات في شريط الأدوات العلوي واختر بنية العصبون المراد تتبعها، وفي هذه الحالة، جسم الخلية، من القائمة المنسدلة.

قم بتتبع جسم الخلية من خلال النقر على نقاط حول أكبر امتداد لجسم الخلية، مع ضبط العمق المحوري z حسب الحاجة لجعل جسم الخلية في بؤرة التركيز، ثم انقر بزر الماوس الأيمن لإنهاء تحديد محيط جسم الخلية. بعد ذلك، ضع علامة بنمط مختلف في مركز محيط جسم الخلية، مع التأكد من أن العلامة تقع تقريباً في المركز من حيث العمق المحوري z.

من الضروري تحديد العمق z الصحيح في المقطع الرئيسي، وكذلك في المقاطع المجاورة، قبل البدء في كل عملية تتبع لضمان دقة قيم المحور z. ولبدء تتبع التفرعات الشجرية، اختر dendrite من القائمة المنسدلة العلوية.

بعد ذلك، تتبع كل شجيرة بدءاً من جسم الخلية. عندما تتفرع الشجيرة، انقر بزر الماوس الأيمن واختر عقدة ثنائية التشعب (bifurcating node) أو عقدة ثلاثية التشعب (trifurcating node) لوضع عقدة عند نقطة التفرع هذه. تأكد من ضبط العمق المحوري (z-depth) طوال عملية التتبع لالتقاط زاوية واتجاه الشجيرة بدقة.

عند نهاية التغصن في هذا المقطع، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "ending" من القائمة المنسدلة. وعندما يتم تتبع جميع التفرعات الشجيرية في المقطع الأساسي، حدد النهايات الشجيرية التي من المرجح أن تستمر في المقطع المجاور، ثم قم بضبط بؤرتها عند عمق z المناسب في صورة المجهر بقوة تكبير 20x.

قم بتضمين المعالم الرئيسية المجاورة في صورة المجهر، مثل الأوعية الدموية أو أنماط التغصنات أو الحزم التي يمكن التعرف عليها بسهولة. بعد ذلك، التقط صورة للصورة الحية باستخدام كاميرا رقمية محمولة باليد موجهة نحو شاشة الكمبيوتر. ثم قم بتغيير العدسة الشيئية للمجهر إلى 2x وانتقل إلى المقطع المجاور على الشريحة.

بعد ذلك، قم بمحاذاة الخطوط الخارجية للمقطع الذي تم تتبعه مسبقاً في عرض البرنامج مع حدود LGN وTRN في المقطع الجديد. عُد إلى التكبير 20x وقم بالمحاذاة باستخدام العلامات المرجعية. ثم، وبمساعدة صورة نهايات الزوائد الشجرية من المقطع الذي تم تتبعه مسبقاً، قم بتحريك التتبع لمحاذاة الزوائد الشجرية عن طريق استخدام أداة السهم أولاً لتحديد عملية إعادة البناء.

بعد ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "move" من القائمة المنسدلة، ثم حرك التتبع وفقاً لذلك. ولتدوير التتبع، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "rotate" من القائمة المنسدلة، ثم قم بتدوير التتبع وفقاً لذلك. بدلاً من ذلك، اختر أداة "match" من قائمة الأدوات المنسدلة العلوية، وحدد عدد النقاط المراد مطابقتها.

بعد ذلك، انقر فوق النهاية في عملية إعادة البناء ونقطة الاستمرار المقابلة لها في الصورة المباشرة لمطابقة نهايات الزوائد الشجرية مع بداياتها. وبمجردما يتم محاذاة التتبع من المقطع السابق مع الزوائد الشجرية في المقطع الجديد، أضف مقطعاً جديداً إلى مدير المقاطع كما فعلت سابقاً. وبدلاً من ذلك، يمكنك ببساطة تحديد المقطع المجاور الذي تم إنشاؤه مسبقاً وضبط عمق z بنفس الطريقة.

تأكد من تحديد القسم الجديد المقابل في مدير الأقسام عن طريق النقر على القسم الحالي. بعد ذلك، قم بزيادة التكبير إلى 40x أو 60x، ثم اختر التغصن باستخدام السهم. انقر بزر الماوس الأيمن على نهاية التغصن من القسم السابق، واختر "إضافة إلى النهاية" (add to ending) من القائمة المنسدلة.

ستظهر رسالة تسألك عما إذا كانت التكملة تقع في مقطع جديد. انقر فوق "نعم". بعد ذلك، قم بتتبع تكملة التغصن باستخدام الماوس كأداة رسم.

التقط صوراً للنهايات تحضيراً لربطها بالمقطع التالي. ثم أضف استكمالات للتتبعات الشجيرية حتى يتم تتبع ثلاث مقاطع على الأقل للعصبون أو حتى يتعذر تتبع الزوائد الشجيرية أو العثور عليها. وباستخدام برنامج استخراج مرتبط بنظام إعادة بناء العصبونات، افتح ملف إعادة بناء مكتملاً.

من القائمة المنسدلة للتعديل (edit)، اختر تحديد كافة الكائنات (select all objects). اختر تحليل بنية الفروع (branch structure analysis) من شريط أدوات التحليل العلوي، ثم انقر فوق كل علامة تبويب وحدد خيارات التحليل المطلوبة في كل منها. استخرج جميع البيانات المطلوبة بالنقر فوق زر موافق (OK) في نافذة التحليل، واحفظها بتنسيق جدول بيانات عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على نوافذ المخرجات واختيار التصدير إلى Excel (export to Excel) لإجراء مزيد من التحليل.

توضح هذه الصورة مقطعاً إكليلياً واحداً عبر النواة الركبية الوحشية (LGN) الظهرية لحيوان واحد. تم استخدام صبغ سيتوكروم أكسيداز لتوضيح طبقات النواة الركبية الوحشية (LGN)، بينما يحدد صبغ GFP موقع حقن الفيروس.

يشير السهم إلى مناطق تحتوي على عصبونات كثيفة في النواة الشبكية المهادية، تم وسمها تراجعياً. اتجاه المقطع وفقاً لبوصلة الاتجاهات (ظهري بطني إنسي وحشي) الموضحة. شريط المقياس موضح في الزاوية السفلية اليسرى.

توضح هذه الصورة الخطوط الكنتورية للنواة الركبية الوحشية (LGN) باللون الأحمر والنواة الشبكية triangulation (TRN) باللون الماروني لجميع المقاطع التي تحتوي على حقن الفيروس كما تشير الخطوط الكنتورية السوداء. تشير النجوم الصفراء إلى مراكز مواقع الحقن. تعرض هذه الصورة التصوير ثلاثي الأبعاد للخطوط الكنتورية وموقع الحقن.

هذه خريطة لمواقع عصبونات TRN المعاد بناؤها، والمكودة بالألوان وفقاً لتعيين التجمع ضمن محيط TRN تجميعي واحد موضح باللون الماروني. يمثل شريط المقياس 500 microns. تُظهر هذه الصورة المحيطات التجميعية لـ TRN باللون الأسود و LGN باللون الرمادي، مع خمس عصبونات TRN معاد بناؤها وملونة من الألوان الدافئة إلى الباردة وفقاً لموقعها الإنسي الجانبي داخل TRN.

يمثل شريط المقياس 500 microns. تُظهر هذه الصور تفاصيل نفس العصبونات الخمسة في TRN مع أشرطة مقياس متطابقة الألوان تمثل 100 microns. يوضح هذا المخطط الشجري الهرمي مسافات الارتباط بين 160 عصبوناً مُعاد بناؤها في TRN بناءً على 10 مقاييس مورفولوجية مستقلة، كما يوضح النتائج العامة لتحليل العنقوديات.

تظهر ثلاث مجموعات متميزة من عصبونات النواة الشبكية المهادية (TRN) باللون الأزرق والأخضر والأحمر. وبمجرد إتقان تقنيات إعادة بناء العصبونات هذه، يمكن إعادة بناء عصبون واحد بالكامل في غضون ساعة إلى ساعتين. ومن المهم مراقبة وضبط العمق المحوري (z-depth) باستمرار أثناء إعادة بناء العصبونات.

يُعد البروتوكول الموضح هنا تحسيناً لطرق التحليل التشريحي العصبي التقليدية الأكثر تحيزاً، وهو يُمكِّن الباحثين من استكشاف فئات فرعية جديدة من العصبونات بناءً على بيانات مورفولوجية واسعة النطاق. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة بناء العصبونات من خلال مقاطع نسيجية متجاورة واستخراج البيانات المورفولوجية لإجراء مزيد من التحليل.